خلاصه‌ای از روش میکروسکوپی رامان
میکروسکوپ رامان یک دستگاه میکروسکوپی مبتنی بر لیزر است که برای انجام طیف سنجی رامان استفاده می‌شود. نام این تکنیک از نام فیزیکدان هندی کاشف این روش نامگذاری شده است که خصوصیات پراکندگی رامان در مایعات را کشف کرده است. میکروسکوپی رامان در واقع ترکیب دو روش میکروسکوپی + طیف سنجی رامان است. شاید بپرسید طیف سنجی رامان و میکروسکوپی هر دو که ملموس هستند، اما ترکیب این طیف سنجی رامان با میکروسکوپی چه معنایی می‌دهد؟ برای پاسخ این پرسش، یک مثال کمک‌کننده است: فرض کنید قسمتی از یک نمونه را زیر میکروسکوپ مشاهده می‌کنید. تصویر نمونه همانند شکل زیر است:
اکنون شما تنها با این تصویر میتوانید ماهیت، نوع و ساختار ماده را شناسایی کنید؟ پاسخ منفی است. این تصویر تنها یک توپوگرافی سطحی از نمونه است و حاوی اطلاعات ساختار ماده (پیوندها، نوع مولکول‌ها و…) نیست. حالا فرض کنید ابزاری داشته باشیم که بتواند در ابعاد میکرونی از نمونه نقطه به نقطه طیف هم بگیرد. حالا ما می‌دانیم در آن نقطه چه ساختار و موادی حضور دارند. اگر اطلاعات هر نقطه را پردازش کنیم و در کنار هم قرار دهیم یک تصویر طیفی رامان ایجاد خواهد شد.
اکنون علاوه بر تصویر معمولی یک تصویر دیگر هم داریم که هر نقطه رنگی در آن نشان دهنده حضور یک ماده متفاوت است که اطلاعات آن برای هر نقطه در دست ماست.
یک مثال دیگر از کاربرد میکروسکوپ‌های رامان، در داروسازی است که شما را بهتر به موضوع نزدیک می‌کند. در یک قرص دارویی گاهی چندین ماده حضور دارند که در ناحیه مرئی تفاوتی با هم ندارند. بنابراین تصویر آن حاوی اطلاعاتی نیست. اما اگر آن‌ها را زیر میکروسکوپ رامان بررسی کنیم، نتایج متفاوت خواهد بود. تصویر را ببینید:
بنابراین با ترکیب کردن قابلیت کانونی کردن نور در یک نقطه توسط میکروسکوپ و طیف سنجی رامان، یک روش خارق‌العاده به وجود می‌آید. این روش را میکروسکوپی رامان می‌گویند.
پس به طور خلاصه روش میکروسکوپی رامان توانایی طیف سنجی از نقاط میکرونی (گاهی اوقات حتی نانویی!) از سطح نمونه است.
میکروسکوپ رامان حاوی یک میکروسکوپ نوری استاندارد است. یک پیکربندی طیف سنجی رامان شامل یک لیزر تحریک، فیلترهای مخصوص لیزر، یک سیستم طیف سنج و یک آشکارساز حساس مثل (CCD) یا (PMT) نیز در این میکروسکوپ به کار رفته است. پس با این دستگاه جدید هم می‌توانیم یک نقطه ریز میکرونی را ببینیم و هم از این نقطه ریز طیف پراکندگی رامان بگیریم.
میکروسکوپ‌های رامان مزیت دیگری نیز نسبت به سایر دستگاه‌های رامان (رامان پرتابل و دستی (Handheld)) دارند و آن کنترل بیشتر بر روی نمونه و ثبت طیف‌های دقیق‌تر (نویز کمتر، بازه اندازه‌گیری بیشتر، شدت بیشتر) است.
کانفوکالیتی یا میکروسکوپ کانفوکال (تصویربرداری سه بعدی از نمونه)
کانفوکال میکروسکوپی در واقع یک تکنیک برای تصویر برداری سه بعدی است. از این تکنیک حتی در برخی از میکروسکوپ‌های نوری غیر طیف سنجی نیز استفاده می شود. بیشترین استفاده از این نوع میکروسکوپ‌های کانفوکال در زمینه میکروسکوپی فلورسانس و در حوزه‌های بیولوژی مرسوم است.
اما تکنیک کانفوکال چیست؟ و چگونه کار می‌کند؟
در تکنیک کانفوکال، نور منبع ابتدا بر روی یک روزنه کانونی شده و نور واگرا شده از روزنه به آینه دیکروئیک (فیلتر ریلی) برخورد می‌کند و توسط یک لنز روی نمونه کانونی می‌شود. در نقطه کانون نور برگشته توسط آن نقطه، توسط لنز جمع‌آوری شده و پس از عبور تقسیم‌گر، بر روی روزنه آشکارساز کانونی شده و وارد آشکار ساز می شود.
نکته مهم در این تکنیک این است که تنها نقاطی از نمونه، توسط آشکارساز ثبت می‌شوند که در نقطه کانونی قرار گیرند. نقاطی که خارج نقطه کانونی باشند، نمی‌توانند از روزنه آشکارساز عبور کنند و توسط آشکارساز ثبت نمی شوند.
در واقع روزنه‌های منبع و آشکارساز ( که Confocal pinholes نیز نامیده می‌شوند) از بین تمام نقاط نمونه، یک گزینش انجام می‌دهند و تنها یک نقطه را نوردهی و آشکارسازی می‌کنند. با این مکانیزم حالا برای ایجاد یک تصویر سه‌بعدی آماده‌ایم: ابتدا با جابجایی دقیق نمونه در راستای عرضی به شکل نقطه به نقطه، تصویر یک صفحه کانونی از نمونه ایجاد می‌شود. با کامل شدن یک صفحه همین فرآیند برای صفحات در راستای Z یا عمق نمونه نیز انجام می‌شود و درنهایت، نقاط ثبت شده توسط رایانه در کنار هم قرارداده می شوند و تصویر سه بعدی نمونه تشکیل خواهد شد.
تصویر زیر یک نمونه از تصاویر سه بعدی است که با روش کانفوکال ثبت شده است. که با روش کانفوکال ثبت شده است:
طیف سنجی رامان کانفوکال
در طیف سنجی رامان کانفوکال از تکنیک میکروسکوپی کانفوکال به همراه طیف سنجی رامان بهره می‌گیریم. در این روش منبع نور یک لیزر خواهد بود. از جفت روزنه‌های کانفوکال نیز بهره خواهیم گرفت و به جای تقسیم‌گر نور نیز از یک فیلتر ریلی استفاده خواهیم کرد تا بتواند نور لیزر فرودی را از پراکندگی‌های رامان برگشتی جدا نماید. آشکارساز نیز که در روش قبلی تنها یک سنسور حساس به نور است، با یک طیف سنج جابجا خواهد شد.
اکنون هر نقطه که در کانون قرار گیرد این بار طیف رامان آن ثبت خواهد شد. و با جاروب مکانی، این کار را برای تمام نقاط یک حجم سه بعدی انجام می‌دهیم. در نهایت رایانه با کنار هم قرار دادن طیف هر نقطه و تناظر یک نقطه رنگی با هر طیف، یک تصویر سه بعدی برای ما ایجاد خواهد کرد.
نمونه یک تصویر رامان پردازش شده با این روش را میتوانید در زیر مشاهده نمایید.
اکنون که مکانیزم روش کانفوکال را فراگرفتیم می‌خواهیم مزیت‌ها و معایب آن را به نسبت میکروسکوپ رامان غیر کانفوکال بررسی نماییم.
آیا با قابلیت کانفوکال می‌توانیم عمق‌های سانتی متری یا میلی‌متری را نیز آنالیز کنیم؟
خیر، عمق آنالیز رامان کانفوکال با توجه به محدودیت‌های اپتیکی در میزان کانونی شدن پرتو، در حد چندین نانومتر تا نهایتا چند ده میکرون است. بنابراین تنها برای مواد میکرونی و بیولوژیکی در این ابعاد می‌توان تصویر برداری سه بعدی رامان داشت.
چه موقع به قابلیت کانفوکالیتی در میکروسکوپ رامان نیاز داریم؟
همان‌طور که در توضیح فرآیند کانفوکال صحبت شد، این قابلیت یک تکنیک تصویرگیری است که اطلاعات مفیدی را در قالب یک تصویر سه بعدی از ساختار نمونه به ما می‌دهد. میکروسکوپ‌های رامان می‌توانند تصاویر دو بعدی را ایجاد کنند. بنابراین هنگامی که ضرورت ایجاب می‌کند تا یک تصویر سه بعدی از نمونه داشته باشید سراغ میکروسکوپ کانفوکال بروید. مراجعه به پایگاه‌های داده‌ای همچون Scopus و تحلیل موارد استفاده طیف سنجی رامان نشان می‌دهد: باتوجه به کاربردهای رامان در شناسایی مواد، که غالبا مواد پودری، مایع یا جامد با حجم بالا هستند برای کاربردهای محدودی ویژگی کانفوکال مفید است.
قیمت یک میکروسکوپ رامان کانفوکال چند برابر یک میکروسکوپ رامان است؟
یک میکروسکوپ رامان کانفوکال با قابلیت تصویربرداری سه بعدی نسبت به یک میکروسکوپ رامان با قابلیت تصویر برداری دو بعدی قیمتی حدود ۴ یا ۵ برابر دارد. دلیل آن نیز استفاده از استیج‌های حرکتی با دقت نانومتر است. با توجه به این که موارد استفاده این تکنیک محدود است، میتوانید ۹۰ درصد کاربردهای خود را با یک میکروسکوپ رامان تهیه شده با قیمت معقول انجام دهید و در صورت نیاز، موارد کانفوکال را به شکل گرفتن خدمات مرتفع کنید.
برای آنالیز چه نمونه‌هایی قابلیت کانفوکال کمک کننده است؟
مراجعه به پایگاه داده Scopus نشان می‌دهد با توجه به ماهیت تصویرگیری این تکنیک استفاده از این روش در نمونه‌های بیولوژیکی و کاربردهایی که لایه نشانی‌های نانومتری چندلایه دارند، دارای بیشترین استفاده است.
هزینه نگهداری سیستم‌های رامان کانفوکال
این سیستم‌ها به دلیل استفاده از المان‌های متحرک تا حدودی نیازمند کالیبراسیون‌های دوره‌ای برای بالا بردن دقت هستند و استفاده از المان‌های با تکنولوژی بالا و گران قیمت در این سیستم‌ها مرسوم است. بنابراین خرید این دستگاه‌ها باید با دقت نظر و دریافت ضمانت‌های معتبر و خدمات پس از فروش قابل اطمینان و ارزان باشد. محیط‌های دارای لرزش بسیارپایین و اتاق‌های تمیز برای استفاده و گرفتن نتایج درست از این سیستم‌ها ضروری هستند، که به نوبه خود هزینه استفاده را تا حدودی افزایش خواهند داد.
منابع
۱-https://zaya.io/3v5fz
۲-https://zaya.io/wxr2c
۳-https://zaya.io/eejzd
