اسپکتروفتومتری

حتما می‌دانید که اسپکتروفتومتری یکی از روش‌های طیف سنجی است. اگر نمی‌دانید اصلا نگران نباشید. ما مطلبی تهیه کرده‌ایم که در‌ آن به طور کامل اسپکتروفتومتری را شرح داده‌ایم. پس اگر به دنبال یافتن پاسخ‌‌های خود در این زمینه هستید، این مطلب به شما پیشنهاد می‌شود.
اسپکتروفتومتری

فهرست مطالب

تاریخچه اسپکتروفتومتری

اسپکتروفتومتر اولین بار در سال ۱۹۴۰ توسط شخصی به نام Arnold O.Beckman اختراع شد. ابتدا او دستگاهی به نام مدل A ساخت که در آن از منشور شیشه‌ای استفاده کرده بود. بکمن مشاهده کرد که منشور شیشه‌ای، نور UV را جذب می‌کند. بنابراین دستگاه دیگری به نام مدل B ساخت. این بار از منشور کوارتز به جای شیشه استفاده کرده بود. در این حالت نتایج رضایت بخش بودند. اما او به این مدل بسنده نکرد و دستگاه‌های خود را ارتقا داد. در نهایت دستگاه D ساخته شد که اکنون به عنوان اسپکتروفتومتر D شناخته می‌شود. این دستگاه از سال ۱۹۴۱ تا ۱۹۷۶ فروخته شد. با متوقف شدن این مدل شخصی به نام Hewlett-Packard اولین اسپکتروفتومتر آرایه دیودی را ساخت.

اسپکتروفتومتری

هر ترکیب شیمیایی نور را در طول موج‌های خاصی جذب یا بازتاب می‌کند. یا این که از خود عبور می‌دهد. حالت دیگر این است که ماده نور را در جهات مختلف پراکنده می‌کند (شکل ۱). حالا زمانی که نور از ماده عبور می‌کند قسمتی از آن جذب می‌شود. هم چنین با افزایش غلظت یک آنالیت در محلول، میزان جذب نور نیز افزایش می‌یابد. اسپکتروفتومتری روشی است که برای اندازه‌گیری میزان جذب نور توسط مواد شیمیایی موجود در یک محلول به کار می‌رود. در این روش یک پرتوی نوری از داخل نمونه عبور می‌کند. ترکیبات موجود در نمونه (مانند آنالیت موجود در محلول)، نور را در طول موج‌های خاصی جذب می‌کنند. به جز طول‌موج‌‌های جذب شده باقی طول‌موج‌ها از ماده عبور می‌کنند. به کمک اسپکتروفتومتری نمونه‌ها را می‌توان به صورت کیفی و کمی تجزیه و تحلیل کرد.

برهم کنش نور و ماده
شکل ۱: پاسخ برهمکنش نور و ماده متفاوت است. ماده می‌تواند نور را از خود عبور دهد، بازتاب، جذب و یا پراکنده کند.

نقطه ایزوبستیک (isosbestic point)

یکی از مباحث جالبی که در اسپکتروسکوپی مطرح می‌شود، نقطه ایزوبستیک است. نقطه ایزوبستیک یا isosbestic point طول موج ویژه‌ای است که در آن طول‌موج، میزان جذب در دو یا چند گونه با هم برابر است. در شیمی از این نقطه به عنوان یک نقطه مرجع در مطالعه میزان واکنش استفاده می‌شود.

isobestic point
شکل ۲: نمونه‌ای از نقطه ایزوبستیک

ابزار مورد استفاده در این روش اسپکتروفتومتر نامیده می‌شود. این دستگاه از اجزای مختلفی تشکیل شده است اما اسپکترومتر و یک منبع نور از اجزای اصلی آن به شمار می‌روند، که در ادامه به آن خواهیم پرداخت. این دستگاه تعداد فوتون‌‌های جذب شده به وسیله آنالیت را اندازه‌گیری می‌کند. در واقع الکترون‌های موجود در یک ماده در اثر تابش نور به ترازهای انرژی بالاتری گذار می‌کنند. ما این پدیده را به عنوان جذب نور توسط ماده می‌شناسیم. در اسپکتروفتومتر شدت نور عبوری از نمونه اندازه‌گیری می‌شود. بنابراین از این طریق میزان نور جذب شده به دست می‌آید.

اسپکتروفتومتر با توجه به محدوده طول‌موجی منبع نور به دو دسته تقسیم بندی می‌شود:

  1. اسپکتروفتومتر UV-VIS: در این دستگاه از منابع نوری فرابنفش (۴۰۰-۱۸۵ نانومتر) و مرئی (۷۰۰-۴۰۰ نانومتر) استفاده می‌شود.
  2. اسپکتروفتومتر IR: از منابع نوری مادون قرمز (۱۴۰۰۰-۷۰۰ نانومتر) استفاده می‌شود. اسپکتروفتومترهای مادون قرمز به دلیل نیاز فنی در اندازه‌گیری‌ها کاملا متفاوت هستند. ساخت این دستگاه‌ها چالش برانگیز است. زیرا تقریبا همه مواد و ابزارها در اثر گرم شدن نور را به صورت پرتو مادون قرمز تابش می‌کنند. از طرفی دیگر موادی مانند پلاستیک و شیشه نور مادون قرمز را جذب می‌کنند. به همین دلیل اسپکتروفتومتر IR نسبت به اسپکتروفتومتر UV-VIS کاربردهای محدودتری دارد.

تا این قسمت از مقاله با اسپکتروفتومتری آشنا شدید. اکنون می‌خواهیم اجزای تشکیل دهنده دستگاه‌های اسپکترومتری را شرح دهیم.

اجزای تشکیل دهنده دستگاه‌‌های اسپکتروفتومتری

در حالت کلی دستگاه‌های اسپکتروفتومتری از اجزای زیر تشکیل می‌شوند:

  1. منبع نوری
  2. المان‌های مربوط به انتخاب طول‌موج
  3. آشکار ساز

البته در ساخت دستگاه اسپکتروفتومتر UV-VIS و IR المان‌های دیگری به کار می‌روند. اما این سه جز در همه آن‌ها ثابت است. البته باید ذکر کرد که این اجزا بین ابزارهای مختلف، متفاوت هستند.

منبع نوری

به طور کلی دو نوع منبع نوری در ساخت اسپکتروفتومترها به کار می‌رود: منابع نوری پیوسته و منابع نوری خطی. منابع نوری پیوسته معمولا لامپ‌ها هستند. لامپ‌‌ها طیف وسیعی از طول‌موج را منتشر می‌کنند. دسته دوم لیزرها و لامپ‌های مخصوصی هستند که برای ایجاد طیف نوری در یک طول‌موج خاص به کار گرفته می‌شوند.

منابع نوری پیوسته

در این منابع از لامپ‌های الکترودی استفاده می‌شود. در این لامپ‌ها محفظه داخلی با گاز خاصی پر می‌شود. سپس یک جریان الکتریکی به وسیله الکترود، گاز درون محفظه را تحریک می‌کند. تحریک گاز سبب می‌شود  تا لامپ در طول‌موج وسیعی تابش کند. در ساخت این لامپ‌ها معمولا از گاز آرگون، زنون، هیدروژن یا دوتریوم و تنگستن استفاده می‌کنند. محدوده تابش این لامپ متفاوت است. در شکل ۲ محدوده تابشی هر یک از گازها نشان داده شده است.

منابع نوری خطی

در این منابع نوری از لامپ‌های غیر الکترودی و لیزر استفاده می‌شود. لامپ‌های غیر الکترودی شامل گاز و قطعه‌ای فلز هستند که طول‌موج خاصی را منتشر می‌‌کنند. در این لامپ‌ها گاز یونیزه می‌شود. سپس اتم‌های فلزی با استفاده از انرژی تحریک گازی تحریک می‌شوند. در نتیجه تابش در طول‌موج بسیار خاصی تولید می‌شود.

محدوده تابشی لامپ های الکترودی
شکل ۳: محدوده تابشی لامپ‌های الکترودی

منابع نوری لیزری بر اساس تحریک خارجی یک ماده خاص کار می‌کنند. در این منابع فوتون‌های نوری که هم انرژی هستند به سمت ماده هدف‌گیری می‌شوند. این امر باعث تولید فوتون در داخل ماده می‌شود. با بازتابش نور لیزر به این ماده فوتون‌های بیشتری تولید می‌شود. از آن جا که تمام فوتون‌ها از انرژی یکسانی برخوردار هستند، همه در یک سطح قرار دارند. همین امر سبب می‌شود تا انرژی و طول‌موج تقویت شود. در نهایت فوتون‌ها در یک پرتو باریک متمرکز شده و به سمت نمونه هدایت می‌شوند.

ساختار لیزر
شکل ۴: ساختار لیزر

المان‌های مربوط به انتخاب طول‌ موج

در اسپکتروفتومترها به دو طریق نور با نمونه برخورد می‌کند. در حالت اول ابتدا طول‌موج پرتو خروجی از منبع نوری انتخاب می‌شود. سپس نور با طول‌موج معین با نمونه وارد برهمکنش می‌شود. در حالت دوم پرتو نوری مستقیما با نمونه برخورد می‌کند و بعد از عبور از نمونه به اجزای تشکیل دهنده‌ خود تجزیه می‌شود.

برای حالت اول از عناصر پراکنده و غیر پراکنده برای انتخاب طول موج استفاده می‌کنند. ولی برای حالت دوم از المان‌‌های پراکنده برای تجزیه نور استفاده می‌شود. در ادامه ما هم عناصر پراکنده و هم غیر پراکنده رو بررسی می‌کنیم.

عناصر غیر پراکنده

این عناصر مواد غیر پراکنده‌ای هستند که محدوده‌های ناخواسته طول‌موجی را فیلتر می‌کنند. از این طریق می‌توان طول‌موج مورد نظر را انتخاب کرد.

فیلترهای UV

فیلترهای UV، نور ماورا بنفش (۴۰۰-۱۰۰ نانومتر) را جذب می‌کنند و باقی طول‌موج‌ها را از خود عبور می‌دهند. این نوع فیلترها اکنون در ساخت اسپکتروفتومترها مورد استفاده قرار نمی‌گیرند. زیرا به طور دقیقی نور فرا بنفش را فیلتر نمی‌کنند.

فیلترهای تداخلی

فیلترهای تداخلی (interference filter) یکی دیگر از المان‌های غیر پراکنده هستند. در این فیلترها طول‌موج مورد نظر در اثر تداخل بین نور تابشی و نور بازتابی در مرز بین ماده‌ها تعیین می‌شود. این فیلترها لایه‌هایی از مواد مختلف دارند که ضریب شکست آن‌ها با هم متفاوت است. این لایه‌ها از جنس ماده دی‌الکتریک، فیلم‌های فلزی نیمه شفاف و شیشه هستند. تابش فرودی با عبور از لایه‌ها با توجه به خواص هر ماده تقسیم‌ می‌شود. اگر نور فرودی که به لایه فلزی دوم می‌رسد دارای طول‌موج مورد نظر باشد با نوری که در آن ناحیه بازتاب شده، تداخل سازنده خواهد داشت و از فیلتر عبور خواهد کرد. در غیر این صورت فیلتر می‌شود. این روش به طور موثری طول‌موج‌های خاص را جدا و تقویت می‌کند. در حالی که طول‌موج‌های دیگر از طریق تداخل مخرب فیلتر می‌شوند (شکل ۵).

مکانیزم فیلتر تداخلی
شکل ۵: فیلتر تداخلی
تداخل‌ سنج‌ها

یکی دیگر از سیستم‌های غیر پراکنده، تداخل‌ سنج‌ها هستند. از تداخل سنج‌ها بیشتر در ساخت اسپکتروفتومترهای IR استفاده می‌شود. معمولا تداخل سنج‌های فابری پرو و مایکلسون به کار می‌روند.

مطالعه مقاله  ارزیابی جاذب های Uv در بسته بندی های دارویی با اسپکتروفتومتر

تداخل سنج فابری پرو

در تداخل سنج فابری پرو، شیشه نیمه نقره اندود یا آلومینیوم اندود که از نظر نوری تخت هستند، سطوح بازتابنده مرزی را تشکیل می‌دهند. پرتو از طریق تیغه‌ای که به طور جزئی نقره اندود شده وارد می‌شود و در فاصله بین دو تیغه چندین بار بازتابیده می‌شود. پرتوهای بازتاب شده به وسیله یک عدسی جمع شده و به کانونی روی یک پرده هدایت می‌شوند که در آنجا باهم تداخل کرده و لکه‌های روشن یا تاریک را تشکیل می‌دهند. از طریق تداخل‌های سازنده و مخرب می‌توان طول‌موج مورد نظر را انتخاب کرد.

تداخل سنج فابری پرو
شکل ۶: تداخل سنج فابری پرو

تداخل سنج مایکلسون

در تداخل سنج مایکلسون ابتدا نور توسط تقسیم کننده پرتو (Beam splitter) به دو قسمت تقسیم می‌شود. باریکه اول با آینه ثابت برخورد کرده و باریکه دوم هم با آینه متحرک برخورد می‌کند. بین این دو پرتو اختلاف راه به وجود می‌آید. حالا اگر طول مسیر باریکه‌‌ای که به سمت آینه متحرک در حرکت است، به اندازه λ/۲ از باریکه دیگر کمتر یا بیشتر باشد، در این صورت تداخل از نوع مخرب است. این تداخل سازنده یا مخرب از طریق آینه متحرک کنترل می‌شود. با حرکت آینه با سرعت ثابت، سیگنال در آشکارساز به صورت سینوسی تغییر می‌کند و هر بار که اختلاف راه دو پرتو مضرب صحیحی از طول‌موج باشد، مقدار ماکزیمم (تداخل سازنده) ثبت می‌شود. باید توجه داشت که در این تداخل سنج هر طول موج با یک فرکانس منحصر به فردی مشخص می‌شود. به طوری که این فرکانس تابعی از طول‌موج تابشی و سرعت آینه متحرک است. بنابراین همه طول‌موج‌ها در این تداخل سنج به صورت خاصی مشخص می‌شوند. از این طریق می‌توان طول‌موج را انتخاب کرد.

تداخل سنج مایکلسون
شکل ۷: تداخل سنج مایکلسون

فیلترهای نوری به طور انتخابی فقط یک قسمتی از طیف نور را عبور می‌دهند. به این ترتیب بخشی از طول‌موج‌ها از فیلتر عبور می‌کنند.

عناصر پراکنده

المان پاشنده با پراکنده کردن پرتوهای تابشی به صورت مکانی و ایجاد طیفی از طول‌موج ها کار می‌کند. در یک منشور پرتوی نور به دلیل ضریب شکست مواد پراکنده می‌شود. به عنوان مثال، هنگامی که نور سفید بر روی یک منشور می‌تابد، نور سفید (که شامل همه طول‌موج‌ها است) به دلیل تفاوت ضریب شکست محیط و هوا به رنگین کمانی از رنگ‌ها تجزیه می‌شود. اما زاویه‌های پراکندگی به دما حساس هستند. به عبارتی با افزایش یا کاهش دما ضریب شکست منشور نیز تغییر می‌کند. با عوض شدن ضریب شکست، زاویه‌ای که نور پراکنده می‌شود هم دچار تغییر می‌شود. از این رو کالیبراسیون دستگاه به هم می‌ریزد. به همین دلیل در بیشتر اسپکتروفتومترهای مدرن به جای منشور از توری استفاده می‌کنند.

 این توری‌ها از شیشه ساخته شده‌اند. به طوری که بر روی آن‌ شیارهای بسیار باریکی حک شده است. در گذشته این شیارها به صورت مکانیکی ایجاد می‌شدند، امروزه این هولوگرافی‌ها طی یک فرایند نوری تولید می‌شود. فاصله شیارها باید از طول موج مورد نظر بیشتر باشد. در غیر این صورت توری نمی‌تواند نور را تجزیه کند. یک پوشش آلومینیومی روی سطح شیشه، جهت بازتاب طول‌موج‌ها اعمال می‌شود. توری‌های هولوگرافی بر خلاف منشورها نسبت به دما حساس نیستند.

جدایی طول موج ها در توری پراش
شکل ۸: توری پراش

آشکارساز

آشکارسازها مبدل‌هایی هستند که خروجی آنالوگ طیف‌سنج را به یک سیگنال الکتریکی تبدیل می‌کنند که با استفاده از یک کامپیوتر قابل مشاهده و تجزیه و تحلیل است. دو نوع آشکارساز وجود دارد: آشکارسازهای فوتونی و آشکارسازهای حرارتی.

آشکارساز فوتونی

اساس کار آشکارسازهای فوتونی به این صورت است که زمانی که فوتون‌ها با آشکارساز برخورد می‌کنند، الکترون‌ها باعث تولید جریان می‌شوند. سلول‌های فتوولتائیک‌ها، فوتوتیوب‌ها و مبدل انتقال بار نمونه‌هایی از این نوع آشکارسازها هستند.

آشکارساز حرارتی

آشکارسازهای حرارتی به دلیل جذب فوتون، تغییر دما در ماده را تشخیص می‌دهند. ترموکوپل‌ها با اندازه‌گیری اختلاف دما بین نمونه و مرجع، افزایش یا کاهش دما را تعیین می‌کنند. از این آشکارسازها معمولا برای شناسایی طول‌موج‌های ناحیه مادون قرمز استفاده می‌شود.

شکل ۹ نواحی آشکارسازی این دستگاه‌ها (آشکارسازهای حرارتی و فوتونی) را نشان می‌دهد.

مقایسه آشکارسازهای فوتونی و حرارتی
شکل ۹: مقایسه آشکارسازهای فوتونی و حرارتی

با توجه به این که با کلیات و اجزای تشکیل دهنده اسپکتروفتومتر آشنا شدید، اکنون می‌خواهیم عملکرد این دستگاه‌ها را شرح دهیم.

عملکرد دستگاه‌‌های اسپکتروفتومتری

در این روش ابتدا طیف جذبی (عبوری) از یک مرجع به دست می‌آید. این کار به این دلیل انجام می‌گیرد که اثرات ناشی از ظروف آزمایشی (ظروفی که نمونه در آن ریخته می‌شود)، محلول‌ و سایر المان‌های دیگر حذف شود. سپس نمونه مورد آزمایش در مسیر نوری قرار می‌گیرد و طیف جذبی (عبوری) آن به دست می‌آید. در نهایت شدت و میزان جذب (عبور) حاصل از نمونه و مرجع مقایسه می‌شود. با این مقایسه میزان جذب (عبور) نور از یک ماده تعیین می‌گردد.

مدل دستگاه‌های اسپکتروفتومتری

انواع دستگاه‌‌ اسپکتروفتومتری با توجه به بازه طول‌موجی و پیکربندی دسته بندی می‌شوند. این دستگاه‌ها از نظر پیکربندی در دو نوع تک پرتو و دو پرتو ساخته می‌شوند. در اسپکتروفتومتر تک پرتو یک محل برای قرارگیری نمونه وجود دارد. مکانیزم سیستم تک پرتو به این صورت است که ابتدا پرتو نور از مرجع عبور می‌کند. سپس مرجع و نمونه با هم تعویض می‌شوند و این بار نور از نمونه عبور می‌کند. در نهایت طیف جذبی نمونه از این طریق به دست می‌آید.

در اسپکتروفتومتر دو پرتو دو محل برای قرارگیری نمونه وجود دارد. در یکی نمونه قرار می‌گیرد و در دیگری مرجع. به این صورت پرتو نوری به روش‌های مختلفی به طور هم‌زمان هم از نمونه و هم از مرجع عبور می‌کند.

تئوری اسپکتوفتومتری

مقدار فوتون‌هایی که از داخل کووت عبور می‌کنند، به طول کووت و غلظت نمونه بستگی دارد. با دانستن شدت نور عبوری از نمونه می‌توان میزان عبور نور را محاسبه کرد. میزان عبور همان بخشی از نور است که از داخل نمونه عبور می‌کند. ضریب عبور را می‌توان با استفاده از معادلات زیر محاسبه کرد:

Transmittance (T) = It / I۰

که در این رابطه، I۰ شدت نور اولیه (یا شدت نور عبوری از مرجع)، It شدت نور عبوری از نمونه است. از آن جایی که جذب و عبور مرتبط باهم هستند، میزان جذب را می‌توان از رابطه زیر به دست آورد:

Absorbance (A) = – log (T) = – log (It/I۰)

طبق قانون بیر لامبرت میزان جذب و غلظت با هم رابطه خطی دارند. این رابطه به شکل زیر بیان می‌شود:

A = ɛlc

در این رابطه A میزان جذب، l طول مسیر نوری (که معمولا طول کووت در نظر گرفته می‌شود، زیرا نمونه معمولا در داخل کووت ریخته می‌شود)، ε ضریب جذب و c غلظت است.

میزان جذب واحد ندارد. زیرا در اثر تقسیم I/I۰ واحد آن از صورت و مخرج کسر حذف می‌گردد. بنابراین معولا از AU (arbitrary units) برای نشان دادن واحد میزان جذب نشان می‌دهند.

نتایج حاصل از اسپکتروفتومتری

همان طور که در بخش قبل اشاره شد، اسپکتروفتومتر میزان عبور نور از ماده را نشان می‌دهد. این دستگاه نتایج را به صورت طیف جذب، چگالی نوری یا میزان عبور نور به عنوان تابعی از طول موج نمایش می‌دهد. به طور معمول بیشتر از طیف جذبی استفاده می‌شود. در طیف جذب محور x نشان دهنده طول‌موج و محور y نشان دهنده میزان جذب نور است. شکل ۴ یک مثال از طیف جذب را نشان می‌دهد.

طیف جذبی
شکل ۱۱: نمونه‌ای از طیف جذب اسپکتروفتومتر. از طیف مربوط به هموگلوبین محلول در بافر فسفات با pH خنثی است.

به کمک تجزیه و تحلیل طیف UV-Vis می‌توان:

  1. اجزای ترکیبات را شناسایی کرد.
  2. غلظت نمونه را تعیین کرد.
  3. از موقعیت قله‌ها اطلاعاتی در رابطه با ساختار نمونه استخراج کرد.
  4. به خصوصیات فیزیکی ماده پی برد.
مطالعه مقاله  کاربرد اسپکتروفتومتری در داروسازی

اسپکتروفتومتری هم مانند همه روش‌‌های طیف‌سنجی دارای نقاط قوت و محدودیت‌هایی است که در بخش بعد به آن‌ها اشاره شده است.

نقاط قوت طیف سنجی Uv-Vis

  1. این تکنیک غیر مخرب است. یعنی به نمونه آسیبی نمی‌زند و شما می‌توانید برای تجزیه و تحلیل‌های بیشتر از نمونه خود استفاده کنید.
  2. اندازه‌گیری به سرعت انجام می‌گیرد.
  3. تجزیه و تحلیل داده‌ها آسان است.
  4. به طور کلی کار با دستگاه آسان است. کاربر با کمترین آموزش می‌تواند آزمایشات خود را انجام دهد.
  5. دستگاه‌‌های اسپکتروفتومتر ارزان هستند و تقریبا برای تمام آزمایشگاه‌ها ضروری‌اند.

محدودیت‌های اسپکتروفتومتری

  1. نورهای سرگردان (stray light): در طیف‌سنج‌ها انتخابگرهای طول‌موج به صورت صد در صدی دقیق نیستند. به بیانی دیگر علاوه بر طول‌موج مورد نظر، بازه وسیعی از طول‌موج ها نیز وارد دستگاه می‌شود. همین امر باعث بروز خطاهایی در دستگاه می‌گردد. علاوه بر این نورهای موجود در محیط اطراف دستگاه هم می‌توانند این خطا را ایجاد کند. اما در این مورد جای نگرانی نیست. مهندسان متخصص و خبره شرکت تکسان میزان stray light را در اسپکتروفتومترهای لِنا به کمترین میزان خودش رسانده‌اند. این مقدار به قدری کنترل شده و بهینه است که حتی شما می‌توانید طیف گیری خود را با درب باز انجام دهید.
  2. پراکندگی نور: مواد جامدی که در نمونه‌های مایع وجود دارند، موجب پراکندگی نور می‌شوند. این امر باعث خطاهای جدی در اندازه‌گیری‌ها می‌شود. علاوه بر این وجود حباب هوا نیز در کووت باعث پراکندگی نور خواهد شد. در نتیجه نتایج غیر قابل تکراری را به همراه خواهد داشت.
  3. تداخل گونه‌های جذب کننده متعدد: برای توضیح این خطا به این مثال توجه کنید. فرض کنید نمونه شما دارای چندین نوع رنگدانه سبز کلروفیل است. کلروفیل‌های مختلف در صورتی که در یک نمونه باشند، طیف جذب آن‌ها همپوشانی خواهد داشت. بنابراین برای تجزیه و تحلیل‌های کمی، قبل از آزمایش هر گونه ی شیمیایی را از نمونه جدا کرده و به صورت مجزا بررسی کنید. در غیر این صورت نتایج به دست آمده صحیح نخواهد بود.
  4. ملاحظات هندسی: موقعیت نادرست هر یک از اجزای دستگاه، به ویژه کووت (یا نگه دارنده نمونه)، ممکن است نتایج غیرقابل تکرار و نادرستی به همراه داشته باشد. بنابراین مهم است که هر جزء در ابزار در جهت یکسان و برای هر اندازه‌گیری در یک موقعیت قرار گیرد. به طور کلی برخی از آموزش‌های اولیه برای جلوگیری از هرگونه خطا توصیه می‌شود.

کاربردهای اسپکتروفتومتر

در مطالب پیش‌تر گفتیم که اسپکتروفتومتر به دو دسته تقسیم می‌شود: اسپکتروفتومتر UV-VIS و اسپکتروفتومتر IR. در این قسمت کاربرد هر یک از اسپکتروفتومترها را به طور مجزا بیان می‌کنیم.

کاربرد اسپکتروفتومتر UV-VIS

اسپکتروفتومتر UV-VIS از اهمیت بسیاری برخوردار است؛ زیرا در زمینه‌های مختلفی به کار گرفته می‌شوند. به عنوان مثال در صنعت برای تعیین کنترل کیفیت مواد (از مواد خوراکی گرفته تا لباس و …) تا بررسی انتشار نور در انواع لامپ‌ها و چراغ‌ها استفاده می‌شود. اسپکتروفتومترها توسط آزمایشگاه‌های تحلیلی برای شناسایی و تعیین کمیت نمونه‌های میکروسکوپی اعم از سینتیک، تطبیق رنگ‌ها، تعیین کیفیت سنگ‌های قیمتی و مواد معدنی، تعیین رنگ جوهر یا رنگ استفاده می‌شوند. به این ترتیب، اسپکتروفتومتر ابزاری بسیار انعطاف‌پذیر با کاربردهای مختلف است. در ادامه برخی از کاربردهای اسپتروفتومتر UV-Vis را بررسی خواهیم کرد.

تجزیه و تحلیل DNA و RNA

بررسی خلوص و غلظت DNA و RNA از موارد پر کاربرد است. برای تجزیه و تحلیل DNA و RNA به وسیله اسپکتروفتومتر فقط چند طول‌‌موج مورد استفاده قرار می‌گیرد. این طول‌موج‌ها در جدول ۱ آورده شده است.

طول‌موج (nm)جذب UV در این طول موج نشان دهنده وجود چه چیزی است؟چه چیزی باعث جذب UV در این طول‌موج می‌شود؟
۲۳۰پروتئیناشکال پروتئین
۲۶۰DNA و RNAآدنین، گوانین، سیتوزین، تیمین، اوراسیل
۲۸۰پروتئینغالبا تریپتوفان و تیروزین
جدول ۱: طول‌موج‌های مورد استفاده در تجزیه و تحلیل DNA و RNA به وسیله اسپکتروفتومتر

در این گونه آزمایش‌ها DNA و RNA نباید آلوده شوند. به همین دلیل یکی از راه های تشخیص آلودگی استفاده از نسبت جذب دو طول‌موج است. نسبت جذب طول‌موج‌های ۲۶۰ نانومتر به ۲۸۰ نانومتر برای آشکارسازی آلودگی‌های احتمالی در نمونه های اسید نوکلئیک است که در جدول ۲ نشان داده شده است. برای DNA اگر این نسبت ۱.۸ باشد می‌توان گفت که DNA خالص است و آلودگی ندارد. این نسبت برای RNA عدد ۲ است. همان طور که می‌بینید جذب DNA نسبت به RNA کمتر است. زیرا در RNA تیمین با اوراسیل جایگزین می‌شود.

نسبت جذب   عدد گزارش شده
۲۸۰/۲۶۰۱.۸ نسبت جذب معمول برای DNA خالص
۲۳۰/۲۶۰۲.۰ نسبت جذب معمول برای RNA خالص
جدول ۲: نسبت‌های جذب طول‌موج‌های مختلف برای DNA و RNA

نسبت جذب طول‌موج‌های ۲۶۰ نانومتر به ۲۳۰ نانومتر برای بررسی خلوص DNA و RNA نیز به کار می‌رود. این نسبت آلودگی پروتئین و یا آلودگی شیمیایی را نشان می‌دهد. پروتئین‌ها می‌توانند نور را در طول‌موج ۲۳۰ نانومتر جذب کنند. بنابراین نسبت ۲۶۰ به ۲۳۰ نانومتر کاهش می‌یابد. این نسبت برای DNA عدد ۲.۵۰ و برای RNA عدد ۲.۱۵ است.

تجزیه و تحلیل دارویی

یکی دیگر از کاربردهای اسپکتروفتومتر در صنعت داروسازی است. از این دستگاه برای شناسایی ترکیبات دارویی استفاده می‌کنند. برای مثال بنزوکائین (دارویی برای بی‌حسی موضعی) و کلرتتراسایکلین (آنتی بیوتیک) را می‌توان به این روش شناسایی کرد.

کشت باکتری

طیف‌سنجی UV-Vis در کشت باکتری نیز استفاده می‌شود. برای اندازه‌گیری غلظت سلولی و ردیابی رشد معمولا طول‌موج ۶۰۰ نانومتر به کار گرفته می‌شود. این طول‌موج به دو دلیل برای تجزیه و تحلیل‌های باکتری مناسب است:

  1. به سلول‌ها آسیب نمی‌رساند.
  2. به دلیل خواص نوری باکتری‌ها این طول‌موج برای آنالیزها مناسب است.

تجزیه و تحلیل نوشیدنی‌ها

شناسایی ترکیبات خاص در نوشیدنی‌ها یکی دیگر از کاربردهای رایج طیف‌سنجی مرئی-فرابنفش است. کافئین موجود در نوشیدنی‌ها را می‌توان با استفاده از این دستگاه تعیین کرد. زیرا کافئین نور فرابنفش را جذب می‌کند.

برخی دیگر از کاربردهای اسپکتروفتومتر شامل موارد زیر است:

  • تشخیص غلظت مواد
  • تشخیص ناخالصی‌ها
  • تشخیص ساختار ترکیبات آلی
  • نظارت بر میزان اکسیژن محلول در اکوسیستم‌های آب شیرین و دریایی
  • تعیین خصوصیات پروتئین‌ها
  • تشخیص گروه‌های عملکردی (functional group)
  • تجزیه و تحلیل گاز تنفسی در بیمارستان‌ها
  • تعیین وزن مولکولی ترکیبات
  • انجام آنالیزهای کمی و کیفی برای DNA، RNA و پروتیین‌ها

کاربرد اسپکتروفتومتر IR

  • واکنش‌های پلیمریزاسیون
  • واکنش‌های فشار بالا
  • واکنش‌های هیدروژناسیون (Hydrogenation Reaction)
  • هیدروفرمیلاسیون یا سنتز
  • مکانیزم‌های واکنش گریگنارد (Grignard reaction)
  • هالوژناسیون (Halogenation Reaction)
  • بیوکاتالیز و تجزیه آنزیمی
  • واکنش‌های کاتالیز شده
  • سنتز شیمیایی

جمع‌ بندی

در این مقاله روش اسپکتروفتومتری را بررسی کردیم. گفتیم اسپکتروفتومتری روشی است که به کمک آن می‌‌توان میزان جذب یا عبور نور از مواد را تعیین کرد. هم چنین بیان کردیم که اسپکتروفتومتری با توجه به بازه طول‌‌موج منبع نور به دو دسته تقسیم می‌شود: اسپکتروفتومتر UV-VIS و اسپکتروفتومتر IR. علاوه بر این اجزای تشکیل دهنده دستگاه‌های اسپکتروفتومتری را شرح دادیم. بعد از آن دستگاه‌‌های دو پرتو و تک پرتو را معرفی کردیم. و در انتها به طور جداگانه کاربرد هر اسپکترفتومتر را هم بیان نمودیم.

منابع

  1. https://zaya.io/npum1
  2. https://zaya.io/8u7zu
  3. https://zaya.io/qrm3k
  4. https://zaya.io/hok3z
  5. https://zaya.io/am132
  6. https://zaya.io/to3kp
مطالب مرتبط
0
افکار شما را دوست دارم، لطفا نظر دهیدx
()
x