اسپکتروفتومتری

تاریخچه اسپکتروفتومتری

اسپکتروفتومتر اولین بار در سال ۱۹۴۰ توسط شخصی به نام Arnold O.Beckman اختراع شد. ابتدا او دستگاهی به نام مدل A ساخت که در آن از منشور شیشه‌ای استفاده کرده بود. بکمن مشاهده کرد که منشور شیشه‌ای، نور UV را جذب می‌کند. بنابراین دستگاه دیگری به نام مدل B ساخت. این بار از منشور کوارتز به جای شیشه استفاده کرده بود. در این حالت نتایج رضایت بخش بودند. اما او به این مدل بسنده نکرد و دستگاه‌های خود را ارتقا داد. در نهایت دستگاه D ساخته شد که اکنون به عنوان اسپکتروفتومتر D شناخته می‌شود. این دستگاه از سال ۱۹۴۱ تا ۱۹۷۶ فروخته شد. با متوقف شدن این مدل شخصی به نام Hewlett-Packard اولین اسپکتروفتومتر آرایه دیودی را ساخت.

اسپکتروفتومتری

هر ترکیب شیمیایی نور را در طول موج‌های خاصی جذب یا بازتاب می‌کند. یا این که از خود عبور می‌دهد. حالت دیگر این است که ماده نور را در جهات مختلف پراکنده می‌کند (شکل ۱). حالا زمانی که نور از ماده عبور می‌کند قسمتی از آن جذب می‌شود. هم چنین با افزایش غلظت یک آنالیت در محلول، میزان جذب نور نیز افزایش می‌یابد. اسپکتروفتومتری روشی است که برای اندازه‌گیری میزان جذب نور توسط مواد شیمیایی موجود در یک محلول به کار می‌رود. در این روش یک پرتوی نوری از داخل نمونه عبور می‌کند. ترکیبات موجود در نمونه (مانند آنالیت موجود در محلول)، نور را در طول موج‌های خاصی جذب می‌کنند. به جز طول‌موج‌‌های جذب شده باقی طول‌موج‌ها از ماده عبور می‌کنند. به کمک اسپکتروفتومتری نمونه‌ها را می‌توان به صورت کیفی و کمی تجزیه و تحلیل کرد.

نقطه ایزوبستیک (isosbestic point)

یکی از مباحث جالبی که در اسپکتروسکوپی مطرح می‌شود، نقطه ایزوبستیک است. نقطه ایزوبستیک یا isosbestic point طول موج ویژه‌ای است که در آن طول‌موج، میزان جذب در دو یا چند گونه با هم برابر است. در شیمی از این نقطه به عنوان یک نقطه مرجع در مطالعه میزان واکنش استفاده می‌شود.

ابزار مورد استفاده در این روش اسپکتروفتومتر نامیده می‌شود. این دستگاه از اجزای مختلفی تشکیل شده است اما اسپکترومتر و یک منبع نور از اجزای اصلی آن به شمار می‌روند، که در ادامه به آن خواهیم پرداخت. این دستگاه تعداد فوتون‌‌های جذب شده به وسیله آنالیت را اندازه‌گیری می‌کند. در اسپکتروفتومتر شدت نور عبوری از نمونه اندازه‌گیری می‌شود. بنابراین از این طریق میزان نور جذب شده به دست می‌آید.

اسپکتروفتومتر با توجه به محدوده طول‌موجی منبع نور به دو دسته تقسیم بندی می‌شود:

1. اسپکتروفتومتر UV-VIS: در این دستگاه از منابع نوری فرابنفش (۴۰۰-۱۸۵ نانومتر) و مرئی (۷۰۰-۴۰۰ نانومتر) استفاده می‌شود.
2. اسپکتروفتومتر IR: از منابع نوری مادون قرمز (۱۴۰۰۰-۷۰۰ نانومتر) استفاده می‌شود. اسپکتروفتومترهای مادون قرمز به دلیل نیاز فنی در اندازه‌گیری‌ها کاملا متفاوت هستند. ساخت این دستگاه‌ها چالش برانگیز است. زیرا تقریبا همه مواد و ابزارها در اثر گرم شدن نور را به صورت پرتو مادون قرمز تابش می‌کنند. از طرفی دیگر موادی مانند پلاستیک و شیشه نور مادون قرمز را جذب می‌کنند. به همین دلیل اسپکتروفتومتر IR نسبت به اسپکتروفتومتر UV-VIS کاربردهای محدودتری دارد.

تا این قسمت از مقاله با اسپکتروفتومتری آشنا شدید. اکنون می‌خواهیم اجزای تشکیل دهنده دستگاه‌های اسپکترومتری را شرح دهیم.

اجزای تشکیل دهنده دستگاه‌‌های اسپکتروفتومتری

در حالت کلی دستگاه‌های اسپکتروفتومتری از اجزای زیر تشکیل می‌شوند:

1. منبع نوری
2. المان‌های مربوط به انتخاب طول‌موج
3. آشکار ساز

البته در ساخت دستگاه اسپکتروفتومتر UV-VIS و IR المان‌های دیگری به کار می‌روند. اما این سه جز در همه آن‌ها ثابت است. البته باید ذکر کرد که این اجزا بین ابزارهای مختلف، متفاوت هستند.

منبع نوری

به طور کلی دو نوع منبع نوری در ساخت اسپکتروفتومترها به کار می‌رود: منابع نوری پیوسته و منابع نوری خطی. منابع نوری پیوسته معمولا لامپ‌ها هستند. لامپ‌‌ها طیف وسیعی از طول‌موج را منتشر می‌کنند. دسته دوم لیزرها و لامپ‌های مخصوصی هستند که برای ایجاد طیف نوری در یک طول‌موج خاص به کار گرفته می‌شوند.

منابع نوری پیوسته

در این منابع از لامپ‌های الکترودی استفاده می‌شود. در این لامپ‌ها محفظه داخلی با گاز خاصی پر می‌شود. سپس یک جریان الکتریکی به وسیله الکترود، گاز درون محفظه را تحریک می‌کند. تحریک گاز سبب می‌شود  تا لامپ در طول‌موج وسیعی تابش کند. در ساخت این لامپ‌ها معمولا از گاز آرگون، زنون، هیدروژن یا دوتریوم و تنگستن استفاده می‌کنند. محدوده تابش این لامپ متفاوت است. در شکل ۲ محدوده تابشی هر یک از گازها نشان داده شده است.

منابع نوری خطی

در این منابع نوری از لامپ‌های غیر الکترودی و لیزر استفاده می‌شود. لامپ‌های غیر الکترودی شامل گاز و قطعه‌ای فلز هستند که طول‌موج خاصی را منتشر می‌‌کنند. در این لامپ‌ها گاز یونیزه می‌شود. سپس اتم‌های فلزی با استفاده از انرژی تحریک گازی تحریک می‌شوند. در نتیجه تابش در طول‌موج بسیار خاصی تولید می‌شود.

منابع نوری لیزری بر اساس تحریک خارجی یک ماده خاص کار می‌کنند. در این منابع فوتون‌های نوری که هم انرژی هستند به سمت ماده هدف‌گیری می‌شوند. این امر باعث تولید فوتون در داخل ماده می‌شود. با بازتابش نور لیزر به این ماده فوتون‌های بیشتری تولید می‌شود. از آن جا که تمام فوتون‌ها از انرژی یکسانی برخوردار هستند، همه در یک سطح قرار دارند. همین امر سبب می‌شود تا انرژی و طول‌موج تقویت شود. در نهایت فوتون‌ها در یک پرتو باریک متمرکز شده و به سمت نمونه هدایت می‌شوند.

المان‌های مربوط به انتخاب طول‌موج

در اسپکتروفتومترها به دو طریق نور با نمونه برخورد می‌کند. در حالت اول ابتدا طول‌موج پرتو خروجی از منبع نوری انتخاب می‌شود. سپس نور با طول‌موج معین با نمونه وارد برهمکنش می‌شود. در حالت دوم پرتو نوری مستقیما با نمونه برخورد می‌کند و بعد از عبور از نمونه به اجزای تشکیل دهنده‌ خود تجزیه می‌شود.

برای حالت اول از عناصر پراکنده و غیر پراکنده برای انتخاب طول موج استفاده می‌کنند. ولی برای حالت دوم از المان‌‌های پراکنده برای تجزیه نور استفاده می‌شود. در ادامه ما هم عناصر پراکنده و هم غیر پراکنده رو بررسی می‌کنیم.

عناصر غیر پراکنده

این عناصر مواد غیر پراکنده‌ای هستند که محدوده‌های ناخواسته طول‌موجی را فیلتر می‌کنند. از این طریق می‌توان طول‌موج مورد نظر را انتخاب کرد.

فیلترهای UV

فیلترهای UV، نور ماورا بنفش (۴۰۰-۱۰۰ نانومتر) را جذب می‌کنند و باقی طول‌موج‌ها را از خود عبور می‌دهند. این نوع فیلترها اکنون در ساخت اسپکتروفتومترها مورد استفاده قرار نمی‌گیرند. زیرا به طور دقیقی نور فرا بنفش را فیلتر نمی‌کنند.

فیلترهای تداخلی

فیلترهای تداخلی (interference filter) یکی دیگر از المان‌های غیر پراکنده هستند. در این فیلترها طول‌موج مورد نظر در اثر تداخل بین نور تابشی و نور بازتابی در مرز بین ماده‌ها تعیین می‌شود. این فیلترها لایه‌هایی از مواد مختلف دارند که ضریب شکست آن‌ها با هم متفاوت است. این لایه‌ها از جنس ماده دی‌الکتریک، فیلم‌های فلزی نیمه شفاف و شیشه هستند. تابش فرودی با عبور از لایه‌ها با توجه به خواص هر ماده تقسیم‌ می‌شود. اگر نور فرودی که به لایه فلزی دوم می‌رسد دارای طول‌موج مورد نظر باشد با نوری که در آن ناحیه بازتاب شده، تداخل سازنده خواهد داشت و از فیلتر عبور خواهد کرد. در غیر این صورت فیلتر می‌شود. این روش به طور موثری طول‌موج‌های خاص را جدا و تقویت می‌کند. در حالی که طول‌موج‌های دیگر از طریق تداخل مخرب فیلتر می‌شوند (شکل ۵).

تداخل‌ سنج‌ها

یکی دیگر از سیستم‌های غیر پراکنده، تداخل‌ سنج‌ها هستند. از تداخل سنج‌ها بیشتر در ساخت اسپکتروفتومترهای IR استفاده می‌شود. معمولا تداخل سنج‌های فابری پرو و مایکلسون به کار می‌روند.

تداخل سنج فابری پرو

در تداخل سنج فابری پرو، شیشه نیمه نقره اندود یا آلومینیوم اندود که از نظر نوری تخت هستند، سطوح بازتابنده مرزی را تشکیل می‌دهند. پرتو از طریق تیغه‌ای که به طور جزئی نقره اندود شده وارد می‌شود و در فاصله بین دو تیغه چندین بار بازتابیده می‌شود. پرتوهای بازتاب شده به وسیله یک عدسی جمع شده و به کانونی روی یک پرده هدایت می‌شوند که در آنجا باهم تداخل کرده و لکه‌های روشن یا تاریک را تشکیل می‌دهند. از طریق تداخل‌های سازنده و مخرب می‌توان طول‌موج مورد نظر را انتخاب کرد.

تداخل سنج مایکلسون

در تداخل سنج مایکلسون ابتدا نور توسط تقسیم کننده پرتو (Beam splitter) به دو قسمت تقسیم می‌شود. باریکه اول با آینه ثابت برخورد کرده و باریکه دوم هم با آینه متحرک برخورد می‌کند. بین این دو پرتو اختلاف راه به وجود می‌آید. حالا اگر طول مسیر باریکه‌‌ای که به سمت آینه متحرک در حرکت است، به اندازه λ/۲ از باریکه دیگر کمتر یا بیشتر باشد، در این صورت تداخل از نوع مخرب است. این تداخل سازنده یا مخرب از طریق آینه متحرک کنترل می‌شود. با حرکت آینه با سرعت ثابت، سیگنال در آشکارساز به صورت سینوسی تغییر می‌کند و هر بار که اختلاف راه دو پرتو مضرب صحیحی از طول‌موج باشد، مقدار ماکزیمم (تداخل سازنده) ثبت می‌شود. باید توجه داشت که در این تداخل سنج هر طول موج با یک فرکانس منحصر به فردی مشخص می‌شود. به طوری که این فرکانس تابعی از طول‌موج تابشی و سرعت آینه متحرک است. بنابراین همه طول‌موج‌ها در این تداخل سنج به صورت خاصی مشخص می‌شوند. از این طریق می‌توان طول‌موج را انتخاب کرد.

عناصر پراکنده

المان پاشنده با پراکنده کردن پرتوهای تابشی به صورت مکانی و ایجاد طیفی از طول‌موج ها کار می‌کند. در یک منشور پرتوی نور به دلیل ضریب شکست مواد پراکنده می‌شود. به عنوان مثال، هنگامی که نور سفید بر روی یک منشور می‌تابد، نور سفید (که شامل همه طول‌موج‌ها است) به دلیل تفاوت ضریب شکست محیط و هوا به رنگین کمانی از رنگ‌ها تجزیه می‌شود. اما زاویه‌های پراکندگی به دما حساس هستند. به عبارتی با افزایش یا کاهش دما ضریب شکست منشور نیز تغییر می‌کند. با عوض شدن ضریب شکست، زاویه‌ای که نور پراکنده می‌شود هم دچار تغییر می‌شود. از این رو کالیبراسیون دستگاه به هم می‌ریزد. به همین دلیل در بیشتر اسپکتروفتومترهای مدرن به جای منشور از توری استفاده می‌کنند.

 این توری‌ها از شیشه ساخته شده‌اند. به طوری که بر روی آن‌ شیارهای بسیار باریکی حک شده است. در گذشته این شیارها به صورت مکانیکی ایجاد می‌شدند، امروزه این هولوگرافی‌ها طی یک فرایند نوری تولید می‌شود. فاصله شیارها باید از طول موج مورد نظر بیشتر باشد. در غیر این صورت توری نمی‌تواند نور را تجزیه کند. یک پوشش آلومینیومی روی سطح شیشه، جهت بازتاب طول‌موج‌ها اعمال می‌شود. توری‌های هولوگرافی بر خلاف منشورها نسبت به دما حساس نیستند.

آشکارساز

آشکارسازها مبدل‌هایی هستند که خروجی آنالوگ طیف‌سنج را به یک سیگنال الکتریکی تبدیل می‌کنند که با استفاده از یک کامپیوتر قابل مشاهده و تجزیه و تحلیل است. دو نوع آشکارساز وجود دارد: آشکارسازهای فوتونی و آشکارسازهای حرارتی.

آشکارساز فوتونی

اساس کار آشکارسازهای فوتونی به این صورت است که زمانی که فوتون‌ها با آشکارساز برخورد می‌کنند، الکترون‌ها باعث تولید جریان می‌شوند. سلول‌های فتوولتائیک‌ها، فوتوتیوب‌ها و مبدل انتقال بار نمونه‌هایی از این نوع آشکارسازها هستند.

آشکارساز حرارتی

آشکارسازهای حرارتی به دلیل جذب فوتون، تغییر دما در ماده را تشخیص می‌دهند. ترموکوپل‌ها با اندازه‌گیری اختلاف دما بین نمونه و مرجع، افزایش یا کاهش دما را تعیین می‌کنند. از این آشکارسازها معمولا برای شناسایی طول‌موج‌های ناحیه مادون قرمز استفاده می‌شود.

شکل ۹ نواحی آشکارسازی این دستگاه‌ها (آشکارسازهای حرارتی و فوتونی) را نشان می‌دهد.

با توجه به این که با کلیات و اجزای تشکیل دهنده اسپکتروفتومتر آشنا شدید، اکنون می‌خواهیم عملکرد این دستگاه‌ها را شرح دهیم.

عملکرد دستگاه‌‌های اسپکتروفتومتری

در این روش ابتدا طیف جذبی (عبوری) از یک مرجع به دست می‌آید. این کار به این دلیل انجام می‌گیرد که اثرات ناشی از ظروف آزمایشی (ظروفی که نمونه در آن ریخته می‌شود)، محلول‌ و سایر المان‌های دیگر حذف شود. سپس نمونه مورد آزمایش در مسیر نوری قرار می‌گیرد و طیف جذبی (عبوری) آن به دست می‌آید. در نهایت شدت و میزان جذب (عبور) حاصل از نمونه و مرجع مقایسه می‌شود. با این مقایسه میزان جذب (عبور) نور از یک ماده تعیین می‌گردد.

مدل دستگاه‌های اسپکتروفتومتری

انواع دستگاه‌‌ اسپکتروفتومتری با توجه به بازه طول‌موجی و پیکربندی دسته بندی می‌شوند. این دستگاه‌ها از نظر پیکربندی در دو نوع تک پرتو و دو پرتو ساخته می‌شوند. در اسپکتروفتومتر تک پرتو یک محل برای قرارگیری نمونه وجود دارد. مکانیزم سیستم تک پرتو به این صورت است که ابتدا پرتو نور از مرجع عبور می‌کند. سپس مرجع و نمونه با هم تعویض می‌شوند و این بار نور از نمونه عبور می‌کند. در نهایت طیف جذبی نمونه از این طریق به دست می‌آید.

در اسپکتروفتومتر دو پرتو دو محل برای قرارگیری نمونه وجود دارد. در یکی نمونه قرار می‌گیرد و در دیگری مرجع. به این صورت پرتو نوری به روش‌های مختلفی به طور هم‌زمان هم از نمونه و هم از مرجع عبور می‌کند.

تئوری اسپکتوفتومتری

مقدار فوتون‌هایی که از داخل کووت عبور می‌کنند، به طول کووت و غلظت نمونه بستگی دارد. با دانستن شدت نور عبوری از نمونه می‌توان میزان عبور نور را محاسبه کرد. میزان عبور همان بخشی از نور است که از داخل نمونه عبور می‌کند. ضریب عبور را می‌توان با استفاده از معادلات زیر محاسبه کرد:

Transmittance (T) = I_t / I_۰

که در این رابطه، I_۰ شدت نور اولیه (یا شدت نور عبوری از مرجع)، I_t شدت نور عبوری از نمونه است. از آن جایی که جذب و عبور مرتبط باهم هستند، میزان جذب را می‌توان از رابطه زیر به دست آورد:

Absorbance (A) = – log (T) = – log (I_t/I_۰)

طبق قانون بیر لامبرت میزان جذب و غلظت با هم رابطه خطی دارند. این رابطه به شکل زیر بیان می‌شود:

A = ɛlc

در این رابطه A میزان جذب، l طول مسیر نوری (که معمولا طول کووت در نظر گرفته می‌شود، زیرا نمونه معمولا در داخل کووت ریخته می‌شود)، ε ضریب جذب و c غلظت است.

کاربردها

در مطالب پیش‌تر گفتیم که اسپکتروفتومتر به دو دسته تقسیم می‌شود: اسپکتروفتومتر UV-VIS و اسپکتروفتومتر IR. در این قسمت کاربرد هر یک از اسپکتروفتومترها را به طور مجزا بیان می‌کنیم.

کاربرد اسپکتروفتومتر UV-VIS

اسپکتروفتومتر UV-VIS از اهمیت بسیاری برخوردار است؛ زیرا در زمینه‌های مختلفی به کار گرفته می‌شوند. به عنوان مثال در صنعت برای تعیین کنترل کیفیت مواد (از مواد خوراکی گرفته تا لباس و …) تا بررسی انتشار نور در انواع لامپ‌ها و چراغ‌ها استفاده می‌شود. اسپکتروفتومترها توسط آزمایشگاه‌های تحلیلی برای شناسایی و تعیین کمیت نمونه‌های میکروسکوپی اعم از سینتیک، تطبیق رنگ‌ها، تعیین کیفیت سنگ‌های قیمتی و مواد معدنی، تعیین رنگ جوهر یا رنگ استفاده می‌شوند. به این ترتیب، اسپکتروفتومتر ابزاری بسیار انعطاف‌پذیر با کاربردهای مختلف است. برخی دیگر از کاربردهای اسپکتروفتومتر شامل موارد زیر است:

• تشخیص غلظت مواد
• تشخیص ناخالصی‌ها
• تشخیص ساختار ترکیبات آلی
• نظارت بر میزان اکسیژن محلول در اکوسیستم‌های آب شیرین و دریایی
• تعیین خصوصیات پروتئین‌ها
• تشخیص گروه‌های عملکردی (functional group)
• تجزیه و تحلیل گاز تنفسی در بیمارستان‌ها
• تعیین وزن مولکولی ترکیبات
• انجام آنالیزهای کمی و کیفی برای DNA، RNA و پروتیین‌ها

کاربرد اسپتکروفتومتر IR

• واکنش‌های پلیمریزاسیون
• واکنش‌های فشار بالا
• واکنش‌های هیدروژناسیون (Hydrogenation Reaction)
• هیدروفرمیلاسیون یا سنتز
• مکانیزم‌های واکنش گریگنارد (Grignard reaction)
• هالوژناسیون (Halogenation Reaction)
• بیوکاتالیز و تجزیه آنزیمی
• واکنش‌های کاتالیز شده
• سنتز شیمیایی

جمع‌ بندی

در این مقاله روش اسپکتروفتومتری را بررسی کردیم. گفتیم اسپکتروفتومتری روشی است که به کمک آن می‌‌توان میزان جذب یا عبور نور از مواد را تعیین کرد. هم چنین بیان کردیم که اسپکتروفتومتری با توجه به بازه طول‌‌موج منبع نور به دو دسته تقسیم می‌شود: اسپکتروفتومتر UV-VIS و اسپکتروفتومتر IR. علاوه بر این اجزای تشکیل دهنده دستگاه‌های اسپکتروفتومتری را شرح دادیم. بعد از آن دستگاه‌‌های دو پرتو و تک پرتو را معرفی کردیم. و در انتها به طور جداگانه کاربرد هر اسپکترفتومتر را هم بیان نمودیم.

منابع

1. https://zaya.io/npum1
2. https://zaya.io/8u7zu
3. https://zaya.io/qrm3k
4. https://zaya.io/hok3z
5. https://zaya.io/am132