قبل از این که به مطالعه این مقاله بپردازید، خوب است بدانید که فرض ما این بوده است که شما با میکروسکوپهای رامان آشنایی دارید. اما اگر تمایل دارید که اطلاعات دقیقتری در مورد این که یک میکروسکوپ رامان چیست، اساس کار یک طیف سنج رامان به چه صورت است و انتخاب مناسبترین لیزر در طیف سنجی رامان چگونه است؛ این مقالهها را مطالعه کنید.
در تصویر زیر یک میکروسکوپ رامان SRM را مشاهده میکنید.
رزولوشن طیفی
اولین تفاوتی که قصد داریم تا به آن اشاره کنیم، رزولوشن طیفی است. قطعا رزولوشن طیفی در دو مدل دستگاه SRM و Eco اختلاف قابل توجهی دارد. رزولوشن طیفی در میکروسکوپهای رامان SRM چیزی حدود (cm-۱) ۳ است. به عبارتی دیگر با این میزان از رزولوشن تقریبا میتوانید بسیاری از مواد که پیکهای شاخص نزدیک به همی دارند را به راحتی شناسایی کنید. شاید برایتان جالب باشد که یکی از سیستمهای SRM شرکت تکسان برای مشخصه یابی آثار و سنگهای باستانی که پیکهای بسیار نزدیک به همی دارند؛ استفاده میشود.
انتخاب رزولوشن طیفی مناسب مورد توجه همه کاربران رامان است و اهمیت بالایی دارد. اما این اهمیت خودش را هنگام خرید طیف سنج رامان و یا انجام کارهای تحقیقاتی روزانه نشان میدهد. احتمالا برایتان جالب باشد که در انتخاب عدد رزولوشن طیفی چه پارامتری تصمیم گیرنده است. در نهایت این حوزه و کاربرد تحقیقاتی شما و یا ماده مورد مطالعهتان است که تعیین کننده این انتخاب است.
مقدار توانایی یک طیف سنج در جدا کردن دو خط طیفی مجاور را میتوانیم رزولوشن طیفی تعریف کنیم. از این تعریف علاوه بر طول موج، میتوان برای عدد موج و یا فرکانس هم استفاده کرد. همان طور که اشاره شد، رزولوشن طیفی مناسب را حوزه کاری شما تعیین میکند. این امر بستگی به این دارد که میخواهید چه اطلاعاتی از مشخصه یابی یک ماده با رامان به دست آورید.
در مقاله رزولوشن طیفی در میکرو طیف سنج رامان، پارامترهای موثر این رزولوشن برای شما به صورت کامل توضیح داده شده است. پیشنهاد میکنیم تا قبل از ادامه مطالعه سایر ویژگیها به این مقاله سر بزنید.
تفاوت رزولوشنهای طیفی مختلف در شکل زیر نشان داده شده است. همان طور که مشاهده میکنید در صورتی که اطلاع درستی از کاربرد خود نداشته باشید، تنها با انتخاب یک رزولوشن اشتباه به راحتی بخشی از اطلاعات مهم را از دست دادهاید. اگر این احساس را داشتید که شاید برای این انتخاب اطلاعات کافی را ندارید و یا این که به مشاوره نیاز دارید، حتما با کارشناسان ما در رابطه با این موضوع تماس بگیرید.
رزولوشن فضایی
در میکروسکوپ رامان، رزولوشن فضایی برای تمایز ساختارهای مختلف در یک نمونه حیاتی است. هرچه میزان رزولوشن فضایی بهتر باشد، میتوان اطلاعات دقیقتری به دست آورد. به عنوان مثال شما میتوانید تمایز اجزای مختلف در یک سلول و یا تشخیص defect در موادی مانند گرافن را مشخص کنید. آبجکتیو میکروسکوپهای نوری (تا بزرگنمایی x100) برای مشاهده نمونه و عبور پراکندگی رامان به طیف سنج استفاده میشود. هنگامی که نور با توزیع انرژی ثابت به آبجکتیو وارد میشود، یک الگوی پراش رخ میدهد. ناحیه روشن ورودی، دیسک هوایی نامیده میشود و اندازه آن (d) را میتوان از روی طول موج (λ) و عدد روزنه (N.A) تعیین کرد. معادله مربوط به آن در زیر آورده شده است.
d= 1.22 λ / N.A
پارامتر d به حد پراشی اشاره دارد که رزولوشن فضایی یک لنز نوری را تعیین میکند. بر اساس معیار ریلی، تعریف تفکیک فضایی در یک صفحه XY بر اساس فاصله بین دو نقطه نزدیک به یکدیگر است. به طور مثال اگر شما یک سیستم با طول موج ۵۳۲ نانومتر، آبجکتیو ۱۰۰، NA=0.90 و spot لیزر با حد پراش d=720 nm داشته باشید؛ رزولوشن فضایی بر اساس معیار ریلی (nm) 360 است.
اگر قصد دارید تا رزولوشن فضایی را بهبود دهید؛ میتوانید طول موج لیزر را کاهش دهید. هم چنین شما میتواند از یک آبجکتیو استفاده کنید که N.A بزرگتری دارد.
به طور کلی بزرگنمایی بیشتر و طول موجهای کوتاهتر لیزر، spot size کوچکتر و در نتیجه رزولوشن بالاتری ایجاد میکند. رزولوشن در تصویربرداری به بزرگنمایی اپتیکی سیستم و اندازه المانها در آشکارساز بستگی دارد. در نهایت این به دلیل ماهیت ذاتی موجی نور، به زیر یک میکرومتر محدود میشود. حالت ایده آل برای این مرحله این است که گام حرکتی استیجها از اندازه کوچکترین spot، کوچکتر باشد.
هر یک از این روشها یک مقدار بهینه دارد. به زبان عامیانه، دست شما تا یک حدی برای جابهجایی این پارامترها باز است. کارشناسان فنی شرکت تکسان تمام این محدودیتها، پارامترها و میزان جابهجا شدنشان را در نظر گرفتهاند تا شما بتوانید رزولوشن فضایی بسیار خوبی داشته باشید. با خیالی راحت و آسوده با میکروسکوپ SRM کار کنید و از کاربرد گسترده آن در همه زمینهها لذت ببرید. رزولوشن فضایی میتواند به شناسایی کیفیت و دقت تصویر کمک کند. رزولوشن فضایی موثر، به نحوه برهمکنش جسم نمایش داده شده با سیستم بستگی دارد.
به طور کلی از رزولوشن فضایی برای ایجاد اطلاعات ساختاری پیشرفته استفاده میکنند و محیطهای پیچیده را مشخص میکنند.
اکنون که با تعریف رزولوشن طیفی آشنا شدیم، بهتر میتوانیم به ویژگی بعدی یعنی تصویربرداری طیفی رامان بپردازیم. در این قسمت به این موضوعات میپردازیم که تصویربرداری طیفی رامان چیست و چگونه تشکیل میشود.
تصویربرداری رامان (Raman Imaging) چیست؟
شما در Raman Imaging (که به آن map رامان هم گفته میشود) میتوانید تغییرات بصری اطلاعات طیفی را در موقعیتهای مکانی مختلف یا داخل یک نمونه مشاهده کنید. در واقع تصویربرداری رامان تکنیکی است که شما در آن میتوانید تصاویر را هم با اطلاعات طیفی و هم با اطلاعات فضایی تهیه کنید. طیفهای رامان از موقعیتهای فضایی مختلفی جمعآوری میشوند. سپس هر طیف تنها به یک مقدار برای پیکسل مربوطه اختصاص پیدا میکند. اینها میتوانند پروفایلهای یک بعدی، تصاویر دو بعدی و یا رندرهای سه بعدی باشند. در این روش شما به سرعت میتوانید چگونگی تغییر پارامترها با موقعیت مکانی را مشاهده کنید. در نتیجه یک روش ویژوال قدرتمند برای نمایش دادههای شما است.
شما میتوانید طیف وسیعی از پارامترها مانند شدت یک باند رامان خاص و یا تجزیه و تحلیل پیچیدهتر از کل طیف را مشاهده کنید.
استفاده از شدت پیک در نشان دادن توزیع و غلظت شیمیایی، رایجترین روش محسوب میشود. از شدت پیکهای متعدد، جابهجایی، نسبت عرض پیکها و … هم برای تولید تصاویر رامان در سناریوهای مختلف استفاده میشود. معمولا مقادیر این پیکسلها در مقیاسهای خاکستری و یا رنگهایی که خودمان مشخص میکنیم؛ نمایش داده میشوند.
یک تصویر شیمیایی شامل اطلاعات مولکولی در هر پیکسل است. این پیکسلها در تصویر رامان کاملا از طیف رامان تشکیل شدهاند. در واقع این تصاویر، تفسیرهای شیمیایی زیادی از این دادههای طیفی است. یک تصویر رنگی تهیه شده میتواند برای تأکید و مشخص کردن ویژگیهای نمونه مانند ساختار شیمیایی ارائه شود.
Raman Image چگونه تشکیل میشود؟
حالا که تا حدی با این موضوع آشنا شدیم که Raman Imaging چیست، زمان آن رسیده است که بدانیم تصویربرداری رامان چگونه تشکیل میشود.
میکروسکوپهای رامان SRM برای ایجاد تصاویر رامان استفاده میشوند و روش آن بسیار دقیق است. طیفهای رامان نقطه به نقطه که در یک منطقه تعریف شدهاند با فواصل شناخته شده به دست میآیند و اطلاعات مکانی را به دادههای رامان اضافه میکنند. در این فرآیند، لیزر بر روی یک نقطه از نمونه متمرکز میشود. در حالی که نمونه آرام آرام زیر لیزر حرکت میکند تا زمانی که کل ناحیه مورد نظر “نقشه برداری” شود.
اطلاعات مکانی به دست آمده می تواند یک، دو و یا سه بعدی باشد. بنابراین حتی امکان اکتشاف شیمیایی در نمونه را نیز فراهم میکند! به این ترتیب میتوان به سؤالات تحلیلی جالبی از جمله اظهاراتی در مورد همگنی پوششها، توزیع اجزا یا اطلاعات مربوط به ذرات و سایر آلایندهها پاسخ داد.
در نقشه برداری رامان به جای یک تصویر با شدت ساده، یک اَبَر مکعب طیفی جمع آوری میشود. این بدان معناست که یک طیف رامان در هر موقعیت از نمونه در یک فایل واحد قرار داده میشود. پس از آن برای تهیه تصاویر رامان آنالیز میشود.
دو تکنیک اصلی برای جمع آوری دادههای طیفی برای تهیه تصاویر وجود دارد.
Point-by-point mapping
لیزر روی یک نقطه متمرکز میشود و نمونه توسط یک استیج motorised حرکت میکند. طیفها به طور متوالی از طیف وسیعی از نقاط، در یک ناحیه خاص که مد نظر شما است، به دست میآیند. این کار را میتوانید به سرعت با استیجهای motoriseed ای که در میکروسکوپ SRM تکرام تعبیه شده است، انجام دهید.
Line focus mapping
این روش هم مشابه mapping نقطه به نقطه است اما با این تفاوت که لیزر به جای یک نقطه، یک خط روی نمونه را روشن میکند. طیف را میتوان از چندین موقعیت در نمونه به طور همزمان جمع آوری کرد. بنابراین سریعتر است. از قدرت لیزر بالاتر میتوان بدون آسیب رساندن به نمونه استفاده کرد. زیرا زمان نوردهی کوتاهتر است. اگر شما هم برای آنالیزهای خود به این روش نیاز دارید با کارشناسان ما در ارتباط باشید.
جمع آوری اطلاعات تا دست یابی به تصاویر
پس از جمعآوری طیفها، میتوان آنها را به روشهای مختلفی برای تهیه پروفایلها، تصاویر و یا حجمهای رندر شده تجزیه و تحلیل کرد.
شدت در تک فرکانس داخل طیف
این بررسی نتایجی مشابه تصویربرداری رامان ایجاد میکند. این بررسی یک روش سریع است. اما مهم است که هنگام آنالیز نتایج مراقب باشید. شدتهای ناشی از باند رامان مد نظر شما میتواند شبیه به شدتهای مرتبط با فلورسانس پسزمینه باشد.
پارامترهای برازش منحنی
هر طیف در یک مجموعه از لحاظ تئوری دارای یک منحنی است که با یکی از باندهای رامان برازش شده است. تصاویر با استفاده از پارامترهای تئوری منحنی برای هر طیف ایجاد می شوند. این تنش یا کریستالیتی در نمونه را با استفاده از فرکانس مرکزی منحنی یا با Full Width at Half Maximum (FWHM) نشان میدهند.
پارامترهای چندمتغیره
تصاویر با استفاده از ابزارهایی که برای دادههای رامان بهینه شدهاند، تهیه میشوند. Empty Modeling تغییرات سیستماتیک بین طیفهای رامان را نشان میدهد و توزیع این تغییرات را در نمونه به عنوان یک تصویر نشان میدهد. دانستن این موضوع که نیازی نیست تا از آن چه در نمونه وجود دارد، دانشی داشته باشید به شما کمک خواهد کرد. تجزیه و تحلیل چند متغیره بسیار قدرتمند است زیرا از اطلاعات کل طیف استفاده میکند، نه فقط یک قسمت (شدت در یک فرکانس) یا یک باند منحنی برازش. تصاویر ایجاد شده با استفاده از این روش معمولا کیفیت بالاتری دارند.
زمان مورد نیاز برای ثبت یک تصویر رامان
اندازه گیری یک تصویر رامان شامل به دست آوردن طیفهای رامان زیادی است. بنابراین برای تصویری که حاوی هزاران یا حتی میلیونها طیف رامان است، کل زمان اندازهگیری میتواند بسیار طولانی باشد. حساسیت در تولید تصاویر رامان از اهمیت کلیدی برخوردار است، که اجازه میدهد زمان کوتاهی برای ثبت هر طیف داشته باشد. بنابراین، انتخاب نمونه هدف، توان لیزر و بازده نوری باید برای گرفتن تصویربرداری سریعتر بهینه شود.
پارامتر بعدی که در این مقاله قصد داریم بررسی کنیم، مبحث کنترل انرژی است.
کنترل انرژی
مشکل رایجی که هنگام کار کردن با نمونههای حساس در طیف سنجی رامان با آن برخورد میکنید، آسیب رساندن به نمونه است. قدرتهای لیزر برای سیستمهای رامان میتوانند دامنه بسیار زیادی داشته باشند. شما در میکروسکوپهای رامان SRM این توانایی را دارید که کنترل انرژی را در گامهای کوچک به دست بگیرید و مقدار آن را کم و زیاد کنید. با این کار میتوانید تا حد خوبی آسیبهای نمونه را کم کنید و یا این که از بین ببرید. اما مطمئنا این تمام ماجرا نیست.
همیشه آسیب نمونه در طیفسنجی لیزری مورد توجه قرار میگیرد و به دلیل ترکیبی از تحریکهای الکترونی و ارتعاشی در طیفسنجی رامان اهمیت ویژهای دارد. همیشه منبع لیزر خود را با در نظر گرفتن طول موج، مدت زمان پالس (در صورت استفاده از منبع لیزر پالسی) و توان تابیده شده بر روی نمونه با دقت انتخاب کنید. ما میدانیم که وسوسه انگیز است که تنها بالاترین توان لیزر ممکن را به نمونه بزنید تا بیشترین سیگنال را دریافت کنید اما در نظر داشته باشید که این میتواند خطرناک باشد و معمولا منجر به خراب شدن نمونه شما میشود. مطمئن شوید که به آرامی توان لیزر را افزایش میدهید تا زمانی که علائم آسیب دیدگی را مشاهده کنید. حالا آن را مجددا به پایین تر از آستانه آسیب تنظیم کنید. با همه این تفاسیر قبل از شروع شناسایی مواد با طیفسنجی رامان، ابتدا چند واقعیت را در نظر بگیرید. یکی از مهمترین اینها درک تأثیری است که نیروی لیزر تحریک بر روی نمونهها دارد. کنترل دقیق بر توان لیزر تحریکی بسیار مهم است. خوشبختانه میکروسکوپ SRM تکرام مجهز به ابزار منحصربهفردی هستند تا کنترل دقیق مورد نیاز را در اختیار شما قرار دهند.
نشانههای آسیب نمونه
نشانههای آشکاری وجود دارد که شما به نمونه آسیب رساندهاید. برخی از آنها را با یکدیگر بررسی میکنیم.
- مشاهده آسیب فیزیکی: یعنی شما میتوانید الگوهای خوردگی/کندگی را روی یک نمونه جامد که در آن لیزر در حال برخورد است، مشاهده کنید. میتوانید یک فیلم تخریب/رسوب از یک نمونه آبی و غیره را ببینید.
- تغییر مکان پیک رامان در طول زمان: اگر تغییر پیک را به فرکانسهای پایینتر مشاهده کردید، این نشانه قویای است که نمونه شما گرم شده است. گرمایش باعث میشود که نمونه در حالت ارتعاشی برانگیخته وجود داشته باشد. بنابراین باعث red shift در سیگنال رامان میشود.
- پهن شدگی در عرض پیک رامان: این گسترش فرکانس نیز به دلیل گرم شدن نمونه است. اگر نمونه در حال گرم شدن باشد، سطوح ارتعاش در حالت الکترونی پایه به طور یکنواخت پر میشود (بر خلاف حالت ارتعاشی پایه، n = 1، که پر شده است). بنابراین، تحریک اولیه لیزر به جای یک سطح، از سطوح مختلف متفاوت خواهد بود و منجر به سیگنال رامان عریضتر میشود.
- شروع مشاهده طیف بک گراند: طیف سنجی رامان یک فرآیند پراکندگی است و بنابراین وابستگی زاویهای زیادی دارد. مثلا در صورتی که یک نمونه جامد آسیب دیده باشد، ممکن است سطح دیگر در سطح میکروسکوپی صاف نباشد. همین موضوع باعث ایجاد یک الگوی پراکندگی متفاوت میشود که اغلب منجر به یک سیگنال زمینه بزرگ میشود.
- تغییرات شدید در طیف رامان: طیف رامان به شدت در حال تغییر است (تبدیل دو پیک به یک پیک، یک پیک به سه پیک و غیره). از آنجایی که با چگالی توان بالا با منابع لیزری سروکار داریم، القای واکنشهای شیمیایی یا حتی انتقال فاز کاملا امکان پذیر است. برای مثال اگر کسی طیف رامان یخ را مطالعه کند و ذوب لیزری نمونه را در نظر نگیرد؛ انتظار میرود که طیف رامان از یخ به آب مایع تبدیل شود.
تاثیر توان لیزر
در اثر تابش نور لیزر به نمونه، ممکن است از دو جهت آسیب پیش بیاید. اول این که ممکن است برخی از مواد با لیزر تحریک آسیب ببینند و یا این که تغییر کنند. این آسیب در موارد شدید که لیزر سوراخی را در نمونه می سوزاند، میتواند بسیار آشکار باشد. در موارد دیگر این آسیب میتواند ظریفتر باشد و اگر برای جلوگیری از آسیبدیدگی نمونه دقت نشود، ممکن است طیفهایی ایجاد شود که نمونه واقعی را نشان نمیدهند. چنین دادههایی به راحتی ممکن است اشتباه تفسیر شوند.
برای این حالت میتوان فولرن C60 را بررسی کرد. در این جا میتوانیم ببینیم که با کمتر از ۰.۵ میلیوات انرژی لیزر که به نمونه وارد میشود؛ شروع به تبدیل شدن به ساختارهای دیگر (احتمالا کربن آمورف) میکند. به نظر میرسد که C60 یکی از حساسترین نانومواد کربنی است. اما حتی زمانی که با مواد مقاومتر به لیزر مانند نانولولههای کربنی سروکار دارید، باید کمی احتیاط کنید. زیرا ممکن است تغییرات سطحی این مواد به اندازه تابش لیزر مقاوم نباشند.
آسیب دومی که ممکن است در برخی موارد به نمونه وارد شود، تغییر دمای نمونه است. طیف رامان بسیاری از نانومواد کربنی حتی میتواند به تغییرات دمایی کوچک بسیار حساس باشد. شکلهای ۲ و ۳ به ترتیب دو نمونه از نانولولههای کربنی چند جداره و نانولولههای کربنی تک جداره را ارائه میدهند. این طیفها نشان میدهند که تغییرات نسبتا کوچک توان لیزر میتواند با ایجاد تغییرات دمایی کوچک در نمونهها همراه باشد که بر روی طیفهای رامان تاثیر گذاشته است.
خوشبختانه راه حلهای نسبتا سادهای برای کنترل این اثرها وجود دارد. یک تحلیلگر همیشه باید زمانی که با مواد جدید یا تغییرات جدید در ماده سر و کار دارد؛ با توان لیزر بسیار کم شروع کند. توصیه میکنیم که اگر تعدادی نمونه از مواد مشابه دارید، ناحیه کوچکی از یک نمونه را برای بررسی تحمل لیزر آزمایش کنید. طیفها را با توانهای مختلف لیزر جمعآوری کنید تا قبل از شروع به دیدن آسیب در طیف رامان، تشخیص دهید که چه مقدار توان میتواند اعمال شود. اگر شما بیشترین توانی را که لیزر به نمونه شما آسیب نمیرساند، پیدا کنید؛ میتوانید با اطمینان اندازهگیریهای خود را پیش ببرید. این کاری است که به سادگی میتوانید با میکروسکوپ رامان SRM تکرام به دلیل کنترل بالایی که روی انرژی دستگاه دارید، انجام دهید.
در این مرحله به سراغ راه حل برای کنترل تاثیر دما روی نمونه میرویم. قسمتی از این راه حل به اپراتور برمیگردد و ممکن است برای شما واضح به نظر برسد. اما باید به آن توجه کرد. از تحریک ناحیهای بزرگتر از ناحیهای که نمونه در آن قرار گرفته، گسیلها جمع آوری شده و روی آشکارساز متمرکز میشوند، اجتناب کنید. هر بخشی از نمونه که در معرض لیزر تحریک قرار میگیرد، اما خارج از دید آشکارساز است به ما هیچ سیگنال رامانی نشان نمیدهد. این موضوع فقط باعث میشود تا در نمونه گرما تولید شود. در بعضی از دستگاهها اندازه laser spot نمونه برابر با اندازه ناحیهای است که آشکارساز مشاهده میکند. یک طراحی اپتیکی مناسب همراه با alignment بسیار دقیق به شما این اطمینان را میدهد که همیشه laser spot تحریک در ناحیهای قرار میگیرد که آشکارساز مشاهده میکند. این موضوع باعث میشود تا شما گرمایش نمونه را به حداقل برسانید و یک کنترل عالی روی تاثیر دما داشته باشید.
پارامتر بعدی در مدیریت و کنترل دمای نمونه که ابتدا هم به آن اشاره شد، توانایی تنظیم توان لیزر در گامهای کوچک است. SRM تکرام دقیقا چیزی را که شما به آن نیاز دارید، ارائه میدهد. حساسیت بالای این دستگاه با توان لیزر کم تمامی مزایای ارائه شده طیف سنجی رامان را با کنترل دقیق پارامترهای اندازه گیری مورد نیاز برای اطمینان کامل از داشتن نتایج عالی ترکیب میکند.
جمع بندی
در این مقاله سعی کردیم تا شما را با میکرو طیف سنج رامان SRM (Super Resolution Microscope) آشنا کنیم. مفاهیمی مانند رزولوشن طیفی، رزولوشن فضایی برای شما توضیح داده شد. این مفاهیم مقدمه درک میکروسکوپ SRM بودند. پس از آن تصویر طیف رامان و چگونگی تشکیل آن را بررسی کردیم. شما در این مقاله میتوانید با اهمیت کنترل انرژی در طیف گیری رامان از نمونه آشنا شوید. هم چنین نشانههای آسیب به یک نمونه برای شما گفته شده است تا به اشتباه دادههای طیفی خود را تفسیر نکنید. شما میتوانید ویدئو عملکرد میکرو طیف سنج رامان SRM را در زیر مشاهده کنید.
منابع
۱- https://zaya.io/tfekx
۲- https://zaya.io/ivbda
۳- https://zaya.io/5c5kf