کاربرد طیف‌ سنجی UV-Vis (اسپکتروفتومتری) در علوم زیستی (Life sience)

دی ۱۶, ۱۴۰۲
هاله کرد حقی-کارشناس ارشد فتونیک
بدون نظرات

مطالعه تمام عوامل زیستی موجود در جهان در علمی به نام علوم زیستی خلاصه می‌شود. از سلول‌ گرفته تا میکرو اورگانیسم‌ها، همه در این دانش مورد مطالعه قرار می‌گیرند. روش‌های متعددی برای بررسی این نمونه‌های زیستی وجود دارد که یکی از پرکاربردترین آن‌ها تکنیک اسپکتروفتومتری است. در این مقاله کاربرد این اسپکتروفتومتری را در علوم زیستی مورد مطالعه قرار داده‌ایم؛ پس با ما همراه باشید.

در زمینه علوم زیستی، طیف‌سنج‌های نوری به ویژه اسپکتروفتومتر نقش مهمی را ایفا می‌کند. طیف‌سنجی UV-Vis یا اسپکتروفتومتری روشی است که در آن آسیبی به نمونه وارد نمی‌شود. بسیار سریع آنالیزها را انجام می‌گیرد و نتایج به دست آمده بسیار دقیق هستند. به همین دلیل اسپکتروفتومترها در آزمایشگاه‌های علوم زیستی به وفور یافت می‌شوند و کاربرد فراوانی در این زمینه دارند. این کاربردها عبارتند از:

اندازه‌گیری غلظت
سینتیک رشد میکرواورگانیسم‌ها
سینتیک و سنجش آنزیم
بررسی pH
تعیین خلوص DNA و RNA
در ادامه کاربردهای ذکر شده را شرح می‌دهیم.

اندازه‌گیری غلظت

برای تعیین غلظت نمونه‌های زیستی مانند DNA از اسپکتروفتومتر UV-Vis استفاده می‌شود. در واقع می‌توان گفت که سریع‌ترین و راحت‌ترین روش اندازه‌گیری غلظت، روش طیف‌سنجی است. نوکلئیک اسید در طول موج ۲۶۰ نانومتر دارای بیشترین جذب است (شکل ۱). آدنین (A)، گوانین (G)، سیتوزین (C) و تیمین (T) که پایه‌های سازنده دی ان ای هستند، نور UV را در طول موج ذکر شده جذب می‌کنند.
DNA تک رشته‌ای و دو رشته‌ای نیز به کمک اسپکتروفتومتری قابل تفکیک است. DNA تک رشته‌ای نور فرابنفش را بیشتر جذب می‌کند. بنابراین اگر به شکل ۱ دقت کنید خواهید دید که ارتفاع قله جذبی در DNA تک رشته‌ای بیشتر از DNA دو رشته‌ای است. این پدیده هایپر کرومیسیتی نامیده می‌شود که ناشی از جفت شدگی پایه‌های تشکیل دهنده دی‌ان‌ای است.

**شکل ۱: طیف جذب DNA تک رشته‌ای و دو رشته‌ای**

برای اندازه‌گیری غلظت دی ان ای نمودار استاندارد یا کالیبراسیون رسم می‌شود. با استفاده از این نمودار و میزان جذب نمونه در طول موج مشخص، غلظت DNA به دست می‌آید.

بررسی سینتیک رشد میکرواورگانیسم‌ها

برخی از میکرواورگانیسم‌ها مانند باکتری‌ها در شرایط محیطی خاصی کشت می‌شوند. نظارت بر فرآیند رشد این میکرو اورگانیسم‌ها با استفاده از اسپکتروفتومتری انجام می‌گیرد. به عنوان مثال باکتری به صورت سوسپانسیون تحت شرایط آزمایشگاهی رشد می‌‌کند. با افزایش تعداد باکتری‌ها سوسپانسیون مورد نظر به مرور زمان کدر می‌شود. در روش اسپکتروفتومتری نور از این سوسپانسیون عبور می‌‌کند. اما به دلیل افزایش پراکندگی نور توسط باکتری‌ها، فقط درصدی از نور به آشکارساز می‌رسد و آشکار ساز این نور را به عنوان جذب ثبت می‌کند. در واقع با گذشت زمان چگالی نوری یا OD (در یک طول موج خاص) اندازه گیری می‌شود و سینتیک رشد باکتری به دست می‌آید. روند این فرآیند در شکل ۲ نشان داده شده است. همان طور که مشاهده می‌کنید، بعد از گذشت تقریبا ۶ ساعت رشد باکتری‌ها متوقف شده است.

مطالعه مقاله نحوه رسم نمودار اسپکتروفتومتری در اکسل

**شکل ۲: نمودار رشد باکتری بر اساس چگالی نور و زمان**

سینتیک و سنجش آنزیم

آنزیم‌ها اغلب در زمینه‌های پزشکی، بیوشیمی و صنایع غذایی مورد استفاده قرار می‌گیرند. احتمالا می‌دانید که آنزیم‌ها سرعت واکنش‌های شیمیایی را بیشتر می‌کنند اما خود وارد واکنش نمی‌شوند. آنزیم‌ها با اتصال به سوبسترا، کمپلکس آنزیم-سوبسترا را تشکیل می‌دهند. طی واکنش‌های شیمیایی سوبسترا به یک یا تعدادی محصول تبدیل می‌شود (شکل ۳). سینتیک آنزیم در واقع سرعتی است که در آن سوبسترا به محصول تبدیل می‌شود. سرعت واکنش به مقدار آنزیم مورد استفاده و سوبسترا بستگی دارد. یکی از ابزارهایی که به کمک آن می‌توان سرعت این واکنش‌ها را اندازه‌گیری کرد، اسپکتروفتومتر UV-Vis است.

اتصال آنزیم و سوبسترا و تشکیل کمپلس آنزیم-سوبسترا — شکل ۳: آنزیم و سوبسترا به هم متصل می‌شوند و کمپلس آنزیم-سوبسترا را تشکیل می‌دهند. سپس طی واکنش محصولات به دست می‌آیند.

اندازه‌گیری سینتیک و سنجش آنزیم از طریق اندازه‌گیری غلظت محصول یا سوبسترا در طول زمان به دست می‌آید. به عنوان مثال در شکل ۴ میزان جذب محصول (در یک طول‌ موج خاص) در طول زمان اندازه‌گیری شده است. از روی این نمودار می‌توان سرعت تولید محصول یا به بیانی دیگر سرعت واکنش را اندازه‌گیری کرد.

نمودار میزان جذب یک محصول در یک طول‌ موج خاص در طول زمان — **شکل ۴: میزان جذب یک محصول در یک طول‌ موج خاص در طول زمان**

بررسی pH در مطالعات علوم زیستی

برخی از پارامترها مانند pH در زندگی روزمره دارای اهمیت ویژه‌ای است و کاربرد گستره‌ای دارد. pH آب، خاک و … می‌تواند محصولات کشاورزی، زندگی آبزیان و به مراتب کل زندگی ما را تحت تاثیر قرار دهد. pH در علوم زیستی بر ساختار و فعالیت ماکرومولکول‌ها اثر می‌گذارد؛ بنابراین مطالعه آن از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. اسپکتروفتومتری یکی از روش‌هایی است که می‌تواند تغییرات pH را ثبت کند. تغییر pH در ماده موجب تغییر طیف‌ جذبی آن می‌شود (شکل ۵).

تغییرات جذب ماده و تغییرات pH — **شکل ۵: تغییرات pH باعث تغییر میزان جذب ماده می‌شود. از این طریق می‌توان تغییرات pH را مورد مطالعه قرار داد.**

تعیین خلوص نوکلئیک اسید

به کمک طیف‌سنجی UV-Vis می‌توان خلوص نوکلئیک اسید را تعیین کرد. نوکلئیک اسید، آروماتیک آمینو اسید‌ها در طول موج ۲۶۰ نانومتر دارای بیشترین جذب هستند. از طرفی پروتئین‌ها در طول‌موج ۲۸۰ نانومتر دارای بیشترین جذب هستند. نسبت جذب در طول موج ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر در واقع میزان خلوص DNA را نشان می‌دهد. برای DNA این نسبت باید بیشتر یا برابر ۱.۸ و برای RNA باید بیشتر یا برابر ۱.۹ باشد. در غیر این صورت DNA‌ یا RNA خالص نبوده و به وسیله پروتئین‌ها آلوده شده است.

مطالعه مقاله شناسایی خاک به کمک طیف سنجی

DNA یا RNA می‌تواند توسط ترکیباتی مانند فنول، اوره یا اتیلن دی آمین تترا استیک اسید نیز آلوده شود. به مراتب خلوص DNA یا RNA کاهش می‌یابد. ترکیبات یاد شده در طول‌موج ۲۳۰ نانومتر دارای بیشترین جذب هستند. اگر عدد به دست آمده از نسبت جذب در طول موج ۲۳۰ و ۲۸۰ نانومتر بین ۲.۲-۱.۸ باشد به این معنی است که DNA یا RNA به ترکیبات یاد شده آلوده نشده است.

جمع‌بندی

اسپکتروفتومتری یا طیف‌سنجی UV-Vis یکی از روش‌هایی است که برای مطالعه علوم زیستی به کار گرفته می‌شود. این روش بسیار سریع است، آسیبی به نمونه وارد نمی‌شود و نتایج به دست آمده از این روش بسیار دقیق هستند. همین ویژگی‌ها سبب شده تا این تکنیک به وفور در این حوزه کابرد داشته باشد. به کلی می‌توان گفت که اسپکتروفتومتری در زمینه علوم زیستی دارای کاربردهای زیر است: