آنالیز هموگلوبین خون به کمک اسپکتروفتومتری

آبان ۲۳, ۱۴۰۱
هاله کرد حقی-کارشناس ارشد فتونیک
بدون نظرات

هر سلولی برای ادامه زندگی به اکسیژن نیاز دارد. احتمالا می‌دانید که هموگلوبین پروتئینی است که اکسیژن را به سلول‌ها می‌رساند. هرگونه نقصی در این فرایند به وجود بیاید، سلول با کاهش یا افزایش غیر عادی اکسیژن مواجه می‌شود. بنابراین آنالیز هموگلوبین خون یکی از آزمایش‌های اساسی است. اسپکتروفتومتری روشی است که به طور دقیق می‌تواند میزان غلظت هموگلوبین خون را اندازه‌گیری کند. در ادامه به طور کامل روش آنالیز را شرح داده‌ایم. پس تا انتهای این مقاله با ما همراه شوید.

هر سلولی برای داشتن عملکرد طبیعی به طور مداوم به اکسیژن نیاز دارد. در طول متابولیسم سلولی اکسیژن مصرف شده و به جای آن کربن دی ‌اکسید تولید می‌شود. یکی از عملکردهای اصلی خون، رساندن اکسیژن (O2) از طریق ریه‌ها به سلول‌های بدن و انتقال کربن دی‌اکسید (CO2) از سلول‌ها به ریه‌ها است. انتقال این گاز‌ها به کمک پروتئین‌ هموگلوبین (Hb) موجود در گلبول‌های قرمز انجام می‌گیرد. به طور معمول در یک میلی لیتر خون، ۲۸۰ میلیون مولکول هموگلوبین وجود دارد.

در هموگلوبین یک مولکلول حاوی آهن که هِم (Heme) نامیده می‌شود با پروتئین‌های گلوبین ترکیب می‌شود و هموگلوبین را تشکیل می‌دهد. هموگلوبین یک پروتئین کروی است که از ۴ زنجیره پلی پپتیدی تشکیل شده است. در مرکز این زنجیره‌ها یک گروه هِم شامل اتم آهن در حالت(^۲+Fe)قرار دارد (شکل ۱). اتم آهن محل اتصال اکسیژن در هموگلوبین محسوب می‌شود. میل ترکیبی هموگلوبین با مونوکسید کربن بیشتر از اکسیژن است. در واقع اگر کسی در معرض مونوکسیدکربن قرار بگیرد، هموگلوبین های او به جای اکسیژن با مونوکسیدکربن ترکیب شده و در نتیجه اکسیژن به سلول ها نمی‌رسد و شخص دچار خفگی می‌شود. اتفاقی که در گاز گرفتگی‌ها می‌افتد دقیقا همین است.

به هموگلوبینی که به اکسیژن متصل می‌شود اکسی هموگلوبین (O_۲Hb) گفته می‌شود. هر اتم آهن با یک مولکول اکسیژن واکنش می‌دهد. بنابراین یک هموگلوبین ۴ مولکول اکسیژن را به سلول‌ها منتقل می‌کند. از طرفی دیگر به هموگلوبینی که با دی اکسید کربن متصل می‌شود، کربو آمینو هموگلوبین (carbaminohemoglobin)گفته می‌شود.

سه گونه از هموگلوبین وجود دارد که اکسیژن نمی‌تواند به این دسته از هموگلوبین‌ها متصل شود:

مِتهموگلوبین (MetHb یا Hi): آهن در گروه هِم در حالت ⁺Fe^۳ است. بنابراین نمی‌تواند به اکسیژن متصل شود.
سولفهموگلوبین (SHb)
کربوکسی هموگلوبین (COHb)

مطالعه مقاله کاربرد طیف سنجی UV-Vis در مدیریت سیستم فاضلاب

در این حالت اگر غلظت یکی از این گونه‌ها افزایش یابد سلول‌های بدن با کاهش اکسیژن مواجه می‌شوند. غلظت این گونه معمولا در اثر مصرف داروی خاص یا استشمام سموم بیشتر می‌شود.

روش‌‌ های اندازه‌ گیری غلظت هموگلوبین

روش‌های متعددی برای اندازه گیری غلظت هموگلوبین وجود دارد. اما روشی که سازمان بهداشت جهانی به استفاده از آن تاکید می‌کند، روش اسپکتروفتومتری است. این روش با توجه به مزیت‌هایی که دارد به طور گسترده در سراسر دنیا برای اندازه‌گیری غلظت هموگلوبین مورد استفاده قرار می‌گیرد. از مزیت‌های استفاده از هموگلوبین متر یا اسپکتروفتومتر می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

همه اشکال هموگلوبین (به جز سولفموگلوبین) به سیانمتهموگلوبین تبدیل می‌شود.
خطای بصری در این روش وجود ندارد. زیرا نیازی به تطبیق رنگ خون نیست.
محلول سیانمتهموگلوبین پایدار است و با گذشت زمان تغییر نمی‌کند. به همین دلیل به راحتی می‌توان آزمایش را انجام داد.
میزان جذب سریعا به دست می‌آید.
یک استاندارد مرجع و معتبر برای مقایسه نتایج وجود دارد.

اندازه‌گیری غلظت هموگلوبین خون (ctHb) به روش اسپکتروفتومتری

برای اندازه‌گیری هموگلوبین خون ابتدا نمونه خون با محلولی حاوی پتاسیم فری‌سیانید (K_۳Fe(CN)_۶) و پتاسیم سیانید (KCN) ترکیب می‌شود. در اثر این ترکیب پتاسیم فری‌سیانید آهن موجود در خون را اکسید می‌کند و متهموگلوبین تشکیل می‌شود. سپس پتاسیم سیانید با متهموگلوبین ترکیب می شود و سیانمتهموگلوبین (HiCN) را تشکیل می‌دهد. در طی این فرآیند بیشتر مشتقات هموگلوبین (اکسی هموگلوبین، متهموگلوبین و کربوکسی هموگلوبین) به HiCN تبدیل می‌شوند. سپس این محلول به دست آمده را در اسپکتروفتومتر قرار می‌دهند. HiCN در طول‌موج ۵۴۰ نانومتر دارای بیشترین جذب است. بنابراین مقدار جذب را در این طول‌موج اندازه‌گیری می‌کنند.

مطالعه مقاله انواع اسپکتروفتومتری(اسپکتروفتومتر، اسپکترومتر، رنگ سنج، نانودراپ، فتومتر)

همان طور که می‌دانید میزان جذب با غلظت نمونه طبق قانون بیر لامبرت رابطه مستقیم دارد. برای تعیین غلظت هموگلوبین (به روش اسپکتروفتومتری)، منحنی استاندارد رسم می‌شود و از این طریق غلظت مجهول به دست می‌آید.

اندازه گیری هموگلوبین با اسپکتروفتومتر — **شکل ۲: هموگلوبین متر**

به عنوان مثال نمودار کالیبراسیون برای اندازه‌گیری غلظت هموگلوبین برای یک دستگاه خاص (در طول موج ۵۴۰ نانومتر) به شکل زیر است. غلظت هموگلوبین مجهول با استفاده از این نمودار به دست می‌آید. به این صورت که میزان جذب در طول موج ۵۴۰ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود. به این ترتیب از روی میزان جذب، غلظت نمونه به دست می‌آید. از روی معادله شیب خط نیز محاسبه غلظت امکان پذیر است.

میزان جذب	غلظت Hb g/dl
۰	۰
۰.۱۲۵	۵
۰.۲۵۰	۱۰
۰.۳۷۵	۱۵
۰.۵۰۰	۲۰
۰.۴۵۶	X=18.24

جمع بندی

هموگلوبین یکی از پروتئین‌های مهم بدن است که وظیفه اکسیژن رسانی به سلول‌های بدن را دارد. روش‌های مختلفی برای آنالیز میزان هموگلوبین خون وجود دارد. اما روشی که توسط سازمان بهداشت جهانی تایید شده است، استفاده از اسپکترفتومتر یا هموگلوبین متر است. در این روش میزان جذب هموگلوبین اندازه‌گیری می‌شود و با استفاده از نمودار کالیبراسیون غلظت هموگلوبین خون به دست می‌آید.